番茄紅素廣泛存在於自然界的超临成熟紅色果實當中,其中番茄、法优方工西瓜、化番石榴中含量較高。茄红在人體的素脂某些器官,例如:血液、质体消化道和肝髒中也存在番茄紅素。超临番茄紅素的法优方工分子式為C40H56,含較多的化番雙鍵,呈開鏈式結構,茄红因此具有很強的素脂抗氧化性。可通過一係列的质体生理生化反應,起到預防心血管疾病、超临控製動脈硬化、法优方工提高免疫功能和延緩衰老等多種重要的化番生理功能。
由於番茄紅素是脂溶性植物色素,而且不飽和開鏈式結構使其具有較差的穩定性,易氧化水解,發生異構化。這在很大程度上限製了番茄紅素的應用與開發。脂質體具有兩親性,將番茄紅素包埋在其中,可有效的提高番茄紅素的應用價值,較大程度上發揮其生物活性。提高番茄紅素的消化穩定性。
目前製備脂質體的方法主要有乙醇注入法、高壓均質法、薄膜超聲法等。這些方法由於引進了較多的有機溶劑,且操作過程繁雜。導致所製備的脂質體結構不穩定。超臨界C02法與這些方法相比,具有綠色環保,操作條件溫和,操作過程簡單易行,所製備出的脂質體無毒無害且結構穩定的優點。脂質體的配方組成會影響脂質體的結構,進而影響所載藥物的穩定性及在人體內的生物利用率。因此本實驗通過優化番茄紅素脂質體的配方組成以期提高脂質體的穩定性,提高番茄紅素在人體中的生物利用率。為番茄紅素的開發利用提供參考依據。
一、儀器與材料
1、實驗儀器
MV-10ASFE超臨界流體萃取係統(上海waters公司),Alpha2—4LDplus冷凍幹燥機,UV-5200紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司),KQ-250DE型數控超聲波清洗裝置(昆山市超聲儀器有限公司),TGl6-WS台式離心機,電子分析天平(上海越平科學儀器有限公司)。
2、實驗材料
C02,純度≥99.5%(哈爾濱卿華工業氣體有限公司),番茄紅素標準品,含量≥98%(瑞楚生物科技有限公司),番茄紅素(LY)粗提物(市售),大豆卵磷脂(PC)(天津市光複精細化工研究所),膽固醇(CH)≥99%(BeijingBiotoppedScience&TechnologyCo.Ltd),磷酸二氫鈉(天津博迪化工股份有限公司),磷酸氫二鈉(天津市天力化學試劑有限公司),無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司),丙酮,正己烷(天津市富宇精細化工有限公司),色譜級正己烷(天津市科密歐化學試劑有限公司)。
二、方法與結果
1、實驗方法
(1)番茄紅素標準曲線的繪製
精密稱取番茄紅素標準品20mg,向其中加入正己烷:乙醇(V:V)為2:1的有機溶劑充分溶解並定容至200mL,製得番茄紅素標準儲備液。分別精密移取適量儲備液取至10mL容量瓶中,製成濃度為10、15、20、25、30μg/mL的係列標準溶液,在474nm處,以番茄紅素濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,平行測定3次,繪製標準曲線,結果如圖1所示。得到回歸方程為:Y=16.24x+0.027,R2=0.994(X為番茄紅素濃度,Y為溶液在474nm處的吸光度)。表明此濃度範圍內,濃度與吸光度有較好的線性關係。
(2)超臨界CO2法製備番茄紅素脂質體
稱取適量番茄紅素粗提物、卵磷脂、膽固醇並加入無水乙醇,超聲10min,得到黃色懸濁液。將懸濁液加入萃取釜中,將磷酸鹽緩衝溶解加入收集瓶中。設定各參數進行製備,待反應結束後,即可在收集瓶中得到番茄紅素脂質體懸濁液。
(3)包封率測定
向製備好的番茄紅素脂質體懸濁液中將入3mL丙酮:正己烷(V:V)=2:1的有機溶劑,3000r/min離心5min,離心2次,收集上清液進行吸光度測定,以空白脂質體為對照,在474nm處測定吸光度。帶入標準方程中,計算遊離的番茄紅素含量W遊。按照下述公式計算包封率:
式中:W總為總的番茄紅素的質量(g);
W遊為遊離的番茄紅素的質量(g)。
(4)單因素試驗
當超臨界溫度45℃,壓強140Pa,時間30min,夾帶劑流速6mL/min時,以脂質體包封率為響應值,考察膽固醇與卵磷脂質量比(g:g)3:20、1:4、7:20、9:20、11:20,磷酸鹽緩衝溶液pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0),番茄紅素與卵磷脂質量比(g:g)1:100、1:50、3:100、1:25、1:20對番茄紅素脂質體包封率的影響。
(5)響應麵法試驗設計
根據單因素試驗結果和Box-Benhnken試驗設計原理,選擇對番茄紅素脂質體影響顯著的配方組成因素進行響應麵試驗設計,如表1所示。
(6)驗證實驗
采用Designexpert8進行相應曲麵優化試驗,根據預測出的最優脂質體配方組成模型,進行3次平行試驗。
2、結果與分析
(1)番茄紅素標準曲線
番茄紅素標準曲線如圖1所示,得到回歸方程為:Y=0.0160X+0.027,R2=0.9939(X為番茄紅素濃度,Y為吸光度)。說明此濃度範圍內,濃度與吸光度有較好的線性關係。
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