對於24例慢性HBV感染患者血清樣本，3種試劑C、商品D和E的化试HBV DNA定量結果的一致性分析見圖4～6。試劑C與D檢測結果的剂对检测结果差值平均值為0.28 log10 IU/mL,差值標準差為0.30 log10 IU/mL,95%一致性界限為0.28±1.96×0.30(-0.30,0.86),95.83%(23/24)的點在95%一致性界限以內，其一致性界限範圍內試劑C和D測定值的临床最大差異為0.85 log10 IU/mL(圖4)。試劑C與E檢測結果的血清响差值平均值為0.80 log10 IU/mL,差值標準差為0.72 log10 IU/mL,95%一致性界限為0.80±1.96×0.72(-0.62,2.21),95.83%(23/24)的點在95%一致性界限以內，其一致性界限範圍內試劑C和E測定值的样本最大差異為1.96 log10 IU/mL(圖5)。試劑D與E檢測結果的定量的影差值平均值為0.51 log10 IU/mL,差值標準差為0.64 log10 IU/mL,95%一致性界限為0.51±1.96×0.64(-0.74,1.77),91.67%(22/24)的點在95%一致性界限以內，其一致性界限範圍內試劑D和E測定值的不同最大差異為1.25 log10 IU/mL(圖6)。3種試劑檢測24例臨床血清樣本的商品差值分布特點見表4。
對於檢測結果低於至少一種試劑定量下限的11例樣本(表5):2例樣本，3種試劑均未檢出；2例樣本，剂对检测结果試劑C和D均檢出，临床但均低於其定量線性下限，血清响而試劑E未檢出；7例樣本，样本試劑C和D的檢測結果均在其定量線性範圍內，經Wilcoxon符號秩和檢驗，試劑C與D的檢測結果間差異無統計學意義(P=0.498),而試劑E有2例未檢出，另外5例雖檢出，但均低於其定量線性下限。對於檢測結果高於至少一種試劑定量上限的8例樣本(表5):1例樣本，檢測結果均高於3種試劑相應定量上限；1例樣本，高於試劑C和D的線性上限，試劑E檢測的結果為8.42 log10 IU/mL;2例樣本，試劑C的檢測結果高於其線性上限，試劑D的檢測結果在其定量線性範圍內，分別為7.38、7.91 log10 IU/mL,試劑E的檢測結果在其定量線性範圍內，分別為7.17、7.68 log10 IU/mL;4例樣本，試劑C和D的檢測結果均高於其線性上限，試劑E檢測的結果分別為7.57、6.75、7.32、6.96 log10 IU/mL。
對於43例慢性HBV感染患者血清樣本，其中有31例血清樣本的檢測結果均在試劑C和D的定量範圍內，相關性分析發現相關係數r=0.966(P<0.001),回歸方程Y=0.903X+0.036。將試劑C檢測這31例血清樣本所得的結果以2000 IU/mL為截斷，分為兩組：≥2000 IU/mL組有18個標本，試劑C與D檢測結果的相關係數r=0.950(P<0.001),回歸方程Y=0.986X-0.235;<2000 IU/mL組有13個標本，試劑C與D檢測結果的相關係數r=0.710(P=0.007),回歸方程Y=0.672X+0.757,提示低病毒血症時2種試劑的檢測結果相關性較差。
HBV DNA是乙型肝炎診治中最重要的分子標誌物，可用於確定治療指征和監測治療等，例如指南建議盡早識別病毒學突破、調整抗病毒治療，而病毒學突破(viral breakthrough)是指患者血清HBV DNA水平與最低值相比上升超過1 log10 IU/mL(10倍)。慢性HBV感染者的精準管理高度依賴於HBV DNA的準確定量，而影響HBV DNA定量準確性的因素很多，包括核酸提取所用樣本量、核酸提取方法、樣品中酶抑製劑、熒光定量PCR儀、PCR反應體係中模板濃度、PCR引物和熒光探針等。HBV DNA在不同的實驗室可能應用不同的試劑檢測，試劑的差異可能改變病毒載量結果，導致HBV DNA定量結果偏高或偏低，特別是在醫學決定水平，因而可能影響臨床決策。另外實驗室在更換檢測試劑時，臨床一致性是最重要的指標，通過它來判斷結果的等效性。因此用於患者診斷或治療管理的決策不僅基於患者的狀態，而且可能還依賴於當時所使用的檢測方法和試劑。
目前我國市麵上有多種國家藥品監督管理局(NMPA)批準的基於熒光定量PCR技術的HBV DNA定量檢測商品化試劑盒。本研究選擇了2種進口試劑和3種國產試劑(表1),2種進口試劑A和B是目前國際通用的HBV DNA定量試劑，但由於價格高昂、檢測成本高而在我國應用有限，更多的實驗室用的還是國產試劑。因此選擇了3種國產試劑C、D和E,為目前國內市場占有率較高的3種試劑，均采用各自配套的半自動化磁珠式核酸提取儀進行核酸提取。由於不同型號的熒光定量PCR儀可能影響檢測結果,將3種試劑均在COBAS®Z480全自動熒光定量PCR分析儀上進行擴增。
本研究主要探討應用不同的試劑檢測臨床血清標本HBV DNA的結果一致性，以評價不同試劑的臨床性能以及在日常臨床實踐中互換使用的可接受性。本研究分為兩部分，第一部分探討不同試劑的差異是否影響HBV DNA檢測結果，首先應用小樣本量的臨床混合血清樣本對此進行驗證，發現兩種進口試劑A和B的檢測結果差異無統計學意義，而C、D和E 3種國產試劑僅有C與試劑A的檢測結果間無統計學差異，試劑D、E的檢測結果均顯著低於試劑A(P<0.05),提示這3種國產試劑的檢測性能可能與國際公認的進口試劑之間存在差異；進一步驗證3種國產試劑的檢測性能，發現2個水平國家標準物質的實際檢測值與其靶值的差值均小於±0.4 log10 IU/mL,符合我國NCCL室間質量評價標準HBV DNA定量檢測的可接受範圍≤±0.4 log10 IU/ml;3種國產試劑C、D、E的CV均小於5%,符合國際上常用的可接受定量標準CV≤5%,因此3種試劑的檢測性能(正確度和精密度)均滿足臨床應用要求。
本研究第二部分擴大樣本量探討3種國產試劑在檢測臨床血清樣本的定量結果一致性以及臨床性能是否存在差異，發現試劑E的檢出率略低於試劑C和D,可能存在漏檢；3種國產試劑檢測24例臨床血清樣本(3種試劑的檢測結果均在其定量範圍內)的結果在統計學上差異有統計學意義，並且分析發現：試劑C與D的相關性和一致性較好、D與E次之、C與E最差；進一步分析試劑C和D檢測31例臨床血清樣本(2種試劑的檢測結果均在其定量範圍內)的結果發現，2種試劑檢測低病毒載量的相關性與高病毒載量時相比差。這些均提示3種HBV DNA定量試劑的臨床性能差異有統計學意義。
本研究中3種國產試劑的正確度和精密度均符合國家要求，但對臨床血清樣本的結果卻存在顯著差異，其原因可能包括：①核酸提取效率可能存在差異：雖然3種國產試劑都是采用敏感的磁珠法提取核酸，但血清上樣量不同，例如試劑E的血清上樣體積是C的3倍而洗脫體積、加入PCR體係的模板體積均相同(表1),理論上E的PCR反應體係中DNA濃度應高於C,但E的檢出率卻低於C,提示核酸提取效率可能存在差異；②PCR擴增效率可能存在差異：由於臨床血清樣本中存在PCR抑製劑如血紅蛋白、肝素等，3種試劑的抗幹擾能力可能不一致，從而導致其擴增效率可能存在差異；③檢測不同基因型和突變病毒株的能力可能存在差異：3種試劑聲稱的檢測亞型稍有差異，但究其各自能力如何未驗證；3種試劑的引物和探針序列可能並不相同，HBV是一種高度變異的DNA病毒，抗病毒治療中HBV DNA序列可能發生耐藥性突變，若突變位於引物或探針結合區域，則可導致樣本的病毒載量被低估；Liu等建議準確定量HBV DNA可能需要兩個靶標，例如基於S和C區域的雙重實時PCR檢測。
總之，本研究發現3種常用國產試劑定量檢測臨床血清樣本HBV DNA的性能存在顯著差異，在常規臨床實踐中互換用於臨床決策時務必慎重。但由於本研究評估臨床性能時所用血清樣本量較小，是否影響臨床決策有待進一步研究。
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