以α-甲基-色氨酸為內標物，液相幼儿建立了堿水解-高效液相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉及特殊醫學用途嬰兒配方食品中色氨酸含量的色谱食品方法。樣品經堿溶液水解，内标C18柱分離，法测熒光檢測器檢測；內標法定量，定婴校正水解過程色氨酸的配方損失，降低基質之間的中色差異，提高定量結果的氨酸準確性；在常見樣品含量水平加標，樣品的含量回收率為92.5%~97.4%之間，相對標準偏差<3.11%，液相幼儿實驗室間偏差＜6.7%。色谱食品方法操作簡單、内标準確度高，法测重複性好，定婴適用於嬰幼兒配方乳粉及特殊醫學用途嬰兒配方食品中色氨酸的配方準確定性定量。
色氨酸是人體的必需氨基酸之一，參與機體蛋白質的合成和代謝調節，它是煙酸、5-羥色胺、褪黑激素等生物活性物質的前體物，影響蛋白質、糖類和脂肪等營養物質的代謝。當人體缺乏色氨酸時會引起皮膚疾患、玻璃體退化及心肌纖維化等病症。相較於成人，嬰幼兒時期生長發育迅速，在該時期色氨酸及其代謝物對大腦的發育和對進食-飽足、睡眠-覺醒規律等神經行為調節發展至關重要，因此必須保證嬰兒食品中營養素的含量和質量。對於消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態的兒童對營養素或膳食有更為特殊的需求。
嬰幼兒配方乳粉和特殊醫學用途嬰兒配方食品作為特定人群的食物來源，其營養成分組成在國家標準中都有特殊規定，對色氨酸的含量和添加形式都有相關的要求，但缺乏相應的檢測方法標準。目前，測定色氨酸的檢測方法有包括分光光度法、電化學法、氨基酸分析儀法、高效液相色譜法、液相色譜串聯質譜法和離子色譜法等，液相色譜方法的特異性和定量準確性均有優勢。色氨酸多以蛋白質的形式存在於樣品中，需水解為遊離態後才能測定。目前通常采用的堿水解方法長時間在高溫、高濃度堿液條件下進行，色氨酸有一定損失，且在不同的基質中色氨酸的損失程度不完全一致。
本研究在經典堿水解方法的基礎上引入結構與色氨酸相似的內標物α-甲基色氨酸，以內標法定量，使同一水解條件同時適用於嬰幼兒配方乳粉和特殊醫學配方嬰幼兒配方食品（乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方）中色氨酸含量的準確測定。
1材料與方法
1.1 材料與試劑
色氨酸標準品（C11H12N2O2，CAS號：73-22-3，純度：99.7%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；α-甲基-色氨酸標準品（C12H14N2O2，CAS號：110117-83-4，純度：98%），上海甄準生物科技有限公司；甲醇(色譜純)，美國Merck公司；醋酸銨（色譜純），美國Fisher Chemical公司；乙酸（色譜純），Fisher Chemical公司色；氫氧化鋰（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；聚四氟乙烯材質水解管，帶螺紋口外蓋，內襯聚四氟乙烯密封墊；水相微孔濾膜（0.22 μm，上海安譜）；NIST配方乳粉質控樣1849a（（184±10）mg/100g, k=2）、NIST配方乳粉質控樣1869（（228±24）mg/100g, k=2）、嬰幼兒配方乳粉和特殊醫學配方嬰幼兒食品（乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方），均為市售。實驗室用水符合 GB /T 6682 規定的一級水要求。
1.2標準溶液配製
色氨酸標準溶液（100 μg/mL）：準確稱取10.0 mg色氨酸標準品用水溶解後定容至100 mL；內標工作液（1 mg/mL）：稱取10 mg α-甲基-色氨酸標準品用水溶解後定容至10 mL。
1.3儀器與設備
Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀配有熒光檢測器，美國Thermo Fisher公司；KQ-800DE超聲清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；MS204TS電子天平，瑞士梅特勒公司；DHG-9243BS-Ⅲ電熱幹燥箱，上海新苗醫療器械製造有限公司；MS 3 basic渦旋混合器，德國IKA公司；IQ 7000超純水儀；美國 Millipore 公司。
1.4樣品前處理
準確稱取混合均勻的固體試樣200 mg（精確到1 mg）於配有密封墊的具塞螺紋口聚四氟乙烯離心管中，依次加入0.5 mL內標工作液、5 mL氫氧化鋰溶液（4 mol/L），渦旋混勻後於超聲波振蕩器中震蕩5 min，保證樣品完全溶解後，置於110 ℃烘箱中水解20 h。取出水解管，待冷卻至室溫後，用鹽酸溶液（4 mol/L）調pH值至3~8，將水解液全部轉移至50 mL容量瓶中並用水定容，混勻後經0.22 μm水相微孔濾膜過濾備用。
1.5儀器條件
色譜柱：Xbridge C18(3.5 μm, 150 mm×4.6 mm)；流動相：A為乙酸銨溶液（10 mmol/L，pH =4.0），B為甲醇，梯度洗脫，洗脫程序見表1；柱溫：35 ℃；進樣體積：5 μL；熒光檢測器激發波長280 nm，發射波長346 nm。梯度洗脫程序見表1，每次進樣前初始流動相比例平衡5 min。
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