固定化生物技術是氨基使水溶性的細胞/酶與水不溶載體在物理或化學方法的作用下成為水不溶性細胞/酶的一類技術。酶同定化技術是甲酸降解究用同體材料將遊離的酶束縛或限製於一定區域，但仍具有催化活性並可重複使用的乙酯一種技術，其優點是固定：1)與遊離酶相比，酶穩定性更高：2)可重複使用，化研節約資源；3)易於從目標物巾實現分離；4)酶活性保留時問長：5)環保，氨基對產物的甲酸降解究影響較小。但也存在以下幾點不足：對同定化技術要求高，乙酯增加成本；製備過程酶活受影響：固定化酶的固定效果受多種因素影響因而存在較大差異。
自1910年酶的化研固定化研究開始，酶的氨基固定化技術也得到了很好的發展，尤其是甲酸降解究酶的固定化新型載體層出不窮。人們常根據不同的乙酯應用需求選擇不同的同定化載體，不僅要求它的固定同定化性能好。比如食品領域就要求高安全性能、化研無汙染性、經濟實用性等。根據固定化載體的組成成分可將其基本分為以下3大類：無機載體(矽藻土、活性炭、多孔陶瓷、玻璃等、天然高分子材料(殼聚糖、澱粉、海藻酸鈉、纖維素等和合成有機材料(常見的有聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、氧化石墨烯等。依據酶與載體的結合方式可將酶的固定化方法分為4類：吸附法是依靠帶電的酶與載體之問的靜電作用，使酶吸附於載體表麵上的一種方法。包埋法是將酶用物理的方法包埋在各種載體(網格或半透膜)內，此法是目前應用最多的一種理想的固定化方法。交聯法是借助雙功能試劑使酶分子和載體之間發生交聯的一種固定化方法.此法固定的酶具有良好的穩定性，常用的雙功能試劑有戊二醛、甲醛、京尼平、雙偶氮苯等。共價偶聯法是借助共價鍵將載體的功能基團(芳香氨基、羥基、羧甲基等)和酶的活性非必需側鏈基團(羧基、巰基、羥基、酚羥基和咪唑基等)進行偶聯的一種方法。
在已有的報道中對固定化酶有如下研究：彭虹旎等以氨基多糖為材料，戊二醛為交聯劑製備了表麵光滑氨基多糖微球載體和多孔氨基多糖微球載體。以此載體對脲酶進行固定化，結果表明：多孔微球載體的同定化效率和同定化酶活力均高於表麵光滑微球載體，因其固定的酶量更多，故表現出更高的酶活力。2015年，王簡之等使用磁性複合微球對脂肪酶進行固定化，得到的固定化脂肪酶在熱穩定性、酸堿耐受性、重複使用率方麵有所提升。在pH4.0，共價固定6h後，固定化脂肪酶的酶活損失低於40％。有研究者將甲基丙烯、問苯二胺水凝膠、殼聚糖和氧化石墨烯反應製備複合材料，製得的複合凝膠在機械強度和吸附能力方麵都有所提升。
凝膠在機械強度和吸附能力方麵都有所提升。同定化酶在提高食品利用率和營養價值方麵有突出貢獻，比如固定化澱粉酶可以將澱粉分解為易被人體吸收的短鏈小分子糖：固定化脂肪酶可用於代可可脂的脫脂；而研究較多的固定化脲酶已應用於酒精飲料中尿素和EC的去除，可以提升發酵飲品的飲用安全性。為了充分發揮脲酶的實用價值，國內外研究者已對脲酶的同定化進行了不少探索，而直到近幾年，國內學者才逐漸展開對EC降解酶的固定化研究。趙雅敏對篩選到的產EC降解酶的菌株LBMAE-8進行研究，發現對該菌進行細胞固定化處理，殼聚糖/海藻酸鈣微膠囊一步法比海藻酸鈣包埋法製得的固定化細胞的酶活回收率高。張遷等將來自P.rettgeriJN-B815的酸性脲酶經乙醇沉澱、離子交換等純化後用殼聚糖微球進行固定化，製備的固定化酸性脲酶的溫度穩定性、pH穩定性及對黃酒中尿素和EC的去除率均有所提升俐。劉小鋒使用氧化石墨烯(GO)和殼聚糖(CS)複合微球對酸性脲酶進行固定化，在流化床反應器中考察同定化酸性脲酶對黃酒的處理效果，該酶對黃酒中尿素的去除率高達93.85％，而對EC的去除率達到57.46％。
固定化酶的酶活力、底物親和力、米氏常數、反應活化能等性質會由於酶的性質、載體材料的性質及包埋條件的不同而發生改變，因此，一般對載體材料和同定化方法經過實驗摸索才能確定最佳方案。通過篩選產EC降解酶的微生物並優化其產酶條件，從而獲得一定數量的EC降解酶並將其應用於國內酒精飲料中EC含量的降低成為目前研究的一個熱點。
作者同繞固定化EC降解酶的固定條件、酶學性質及應用展開研究，為保障發酵飲品的安全性提供理論支持。
選取經活化和優化培養的CAT-4(Kluyvero-mycesmarxianus)酵母菌株作為出發菌株，取其發酵液通過反複凍融結合超聲破碎法得到EC降解酶粗酶液，待用。乙醇(色譜純)：天津致遠公司產品；氨基甲酸乙酯、正丙基甲酸酯：Sigma-aldrich公司產品：其餘溶劑均為分析純。
DVB/CAR/PDMS(50/30pom)SPME萃取頭、7890B-5977A氣相色譜質譜聯用儀：美國Agilent公司產品：FRESCO21高速冷凍離心機：ThermoFisherScientific公司產品：AS-4S超聲細胞破碎儀：寧波新芝生物技術股份有限公司產品；722型可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司產品。
稱取0.5g殼聚糖溶解於50mL體積分數1.0％的醋酸溶液中，置於搖床上活化2h，將活化的殼聚糖用注射器逐滴加入含有質量分數20％NaOH和體積分數30％CH3OH的凝結液中，挑選出粒度均勻、形狀規整的殼聚糖微球，用去離子水洗至中性，冷藏備用。
將上述製備的微球置於體積分數6％戊二醛溶液巾，在30℃恒溫水浴鍋巾振蕩6h。反應完成後，用去離子水反複洗滌，以去除剩餘的戊二醛，直至洗滌液在280nm處的吸光度小於0.01，即得戊二醛交聯殼聚糖微球載體。
取一定量戊二醛交聯殼聚糖微球載體，加入適量CAT-4菌株產生的粗酶液，置於30℃恒溫水浴搖床上振蕩1h。分離棄去上層溶液，用去離子水反複洗滌沉澱物，得到後續實驗所用的同定化EC降解酶。
配製體積分數2％、3％、4％、5％、6％和7％的戊二醛溶液，用注射器將冷藏的殼聚糖微球緩慢滴加至不同體積分數的戊二醛溶液巾，使其形成直徑均勻的微球，在30℃恒溫水浴鍋中振蕩6h。反應結束後，用去離子水反複洗滌，直至洗滌液在280nm處的吸光度小於0.01，即得戊二醛交聯殼聚糖微球載體，置於4℃冰箱保存。用羥胺法[27]測其懸掛醛基質量分數。
用注射器將冷藏的殼聚糖微球緩慢滴加至體積分數為6％的戊二醛溶液中，使其形成形狀規整、均勻的微球，在30oC恒溫水浴鍋中振蕩2、4、6、8、10h。其餘操作同1.3.1中4)。
分別將1mL粗酶液或1g固定化EC降解酶和超純水加到2支裝有1mL質量分數3％EC溶液的10mL比色管巾，將比色管置於37℃水浴鍋中反應15min後加入1mL終止劑，充分混勻後依次加入各1mL的顯色劑I和顯色劑Ⅱ,強烈振蕩後繼續置於37。C水浴條件下保溫20min，用超純水定容至刻度線，測定並記錄A625nm值。酶活計算公式如下：
式中：M為酶活力；△A625nm為反應結束後空白對照與樣品測定的光密度值之差：n為待測樣液的稀釋倍數：k為NH4+標準曲線中斜率的倒數。
參考文獻使用濁度滴定法測定雙水相體係的二元曲線。具體做法如下：將乙醇逐滴加入盛有已知濃度K2HPO。溶液的玻璃容器中，直到在25℃時形成界限清晰的兩相體係。記錄此時乙醇和K2HPO4組成。在此基礎上，將去離子水滴加到玻璃容器中，得到一個清晰的單相體係，繼續滴加乙醇，再形成兩相體係，如此反複。接著用不同質量濃度的K2HPO4重複上述步驟，記錄數據。
提取“美樂”葡萄酒中EC圖1顯示了用乙醇和K2HPO4雙水相體係提取EC的原理。以含50μg/LEC和100μg/L正丙基甲酸酯(PC)的體積分數55％乙醇溶液作為模型溶液，用酒石酸和NaOH調節pH並記錄當前的pH。
量取5mL模型溶液和過量的K2HPO4固體加人離心管中，混勻後以4000r/min離心5min，以確保兩相完全分離。將離心管置於25℃恒溫水浴中持續3.5h達到相平衡。記錄頂相體積並取1.5mL的頂部溶液與150mg無水硫酸鎂完全混合，在轉速為12000r/min的條件下離心1min。最後，將1mL上清液通過0.45μm膜過濾，用於GC-MS分析。
使用Agilent7890BGC-5977AMS係統進行EC的定量和定性分析。氣相色譜柱為Carbowax20M(30m×0.25μm×0.25mm)，以氦氣為載氣，流量為1.0mL/min，進樣口溫度200℃，檢測器溫度250℃。柱溫采用程序升溫：初始溫度50℃保留1min，以3℃/min升至180℃保留1min，然後以20℃/min升至220℃，保留10min。
質譜條件：以氦氣為載氣.采用電子轟擊源(EI)的電離模式，電子能量70eV；四級杆溫度150℃；離子源溫度230℃；選取離子監測(SIM)模式，選擇質荷比(m/z)分別為62、74和89作EC的監測離子，m/z為62作定量離子：選擇m/z分別為59、62和89來監測PC，m/z為62作定量離子。
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