①測定DPPH·清除能力

參考Kumaran等及Floegel等的单枞的抗方法並作改進。將單樅茶酒樣品作一係列濃度地稀釋，茶酒將每一稀釋度樣品溶液加到2支5mL試管中，氧化每支試管加0.2mL樣品液；然後在一支試管中加入1×10^-4mol/L的活性DPPH乙醇溶液3.8mL，在另一支試管中加入3.8mL乙醇，单枞的抗兩支試管充分搖勻後於室溫下置於黑暗處孵育30min，茶酒然後於波長517nm處測定吸光度。氧化用乙醇作空白。活性按下式計算DPPH·清除率(I_D)：

I_D(％)=[1～(A₁—A₂)／Ao]×100

式中，单枞的抗A₁：0.2mL茶酒樣液+3.8mLDPPH乙醇溶液的茶酒吸光度；

A₂：0.2mL茶酒樣液+3.8mL乙醇的吸光度；

Ao：0.2mL乙醇+3.8mLDPPH乙醇溶液吸光度。

②測定ABTS·清除能力

參照Dudonne等的氧化方法並作改進。取7mmol／L的活性ABTS溶液5mL，加入到88μL0.14mol／LK₂S₂O₈溶液中，单枞的抗混勻，茶酒室溫下避光靜置12h，氧化即得ABTS·儲備液。實驗前用10mmo/LpH7.4的磷酸緩衝液稀釋成工作液，使其在波長734nm下吸光度為0.70±0.02。將單樅茶酒作一係列濃度地稀釋，取10μL樣品液加到200μLABTS工作液中，混勻並靜置6min後測定波長405nm下的吸光度。以純溶劑作空白。按下式計算ABTS·清除率(I_A)：

I_A(％)=(1-A₁／Ao)×100

式中，A₁：茶酒樣液的吸光度；

Ao：空白的吸光度。

③測定·OH清除能力

參考候學敏等的方法並稍作改進。將單樅茶酒樣品液用dd水作一係列濃度地稀釋。取10mL小試管若幹，分別依次加入8mmol／。FeS0₄溶液2mL、8mmol／L水楊酸-乙醇溶液2mL以及不同濃度的單樅茶酒樣品液2mL，以dd水作空白，最後加入8.5mol／LH₂0₂溶液2mL，搖勻後於40℃水浴中靜置20min，然後4000r/min離心5min，取上清液於波長510nm處測定吸光度，參比溶液以dd水替代H₂O₂溶液。按下式計算·0H清除率(I_H)：

I_H(％)=[1-(A_n-A_d)／A_o]×100

式中，A_o：空白吸光度；

A_n：加入茶酒樣液後吸光度；

A_d：參比溶液吸光度。

④測定0₂^-·清除能力

參考PaVithm等及候學敏等的方法並作改進。取10mL小試管若幹，分別加入4.5mLpH8.O的Tris-鹽酸緩衝液，於30℃水浴中靜置15min，在各試管中分別加入0.2mL不同濃度的單樅茶酒樣品液以及30℃預熱過的3mmol／L的鄰苯三酚溶液0.3mL(用10mmo/L鹽酸配製)，搖勻後於30℃水浴中靜置5min，然後迅速加入5滴8mol/L鹽酸終止反應。用dd水作空白對照，在波長325nm處測定吸光度。按下式計算O₂^-·清除率(Is)：

I_s(％)=(A_o-A_n)／A_o×100

式中，A_o：空白的吸光度；

A_n：加入茶酒樣液後的吸光度。

（4）抗氧化能力指數(ORAC)的測定

ORAC法是抗氧化研究領域關注較多的一種抗氧化活性評價方法，目前已成功應用於生物製品、食品、化學品及天然植物提取物等多種樣品的抗氧化能力分析。具體測定步驟如下：

①準確稱取AAPH0.414g，用75mmol／LpH7.4的磷酸緩衝液溶解並定容至10mL，即得153mmol／L的AAPH溶液。

②準確稱取FL0.04g，用75mmol／LpH7.4的磷酸緩衝液溶解並定容至25mL，即得4.25mmol/L的FL貯液甲；吸取FL貯液甲0.05mL並以磷酸緩衝液定容至50mL，即得4.25×10-3mmol／L的FL貯液乙；然後將FL貯液甲和FL貯液乙置於4℃備用。實驗時吸取FL貯液乙0.5mL並以磷酸緩衝液定容至25mL，可得8×10-3mmo兒的稀釋液。

③準確稱取2.5mgTrolox，用甲醇溶解並定容至10mL，即得1mmol／L的Trolox溶液。實驗時分別吸取Trolox溶液l、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mL於10mL容量瓶，用75mmol/LpH7.4磷酸緩衝液定容，即得不同濃度Trolox溶液。

④量取單樅茶酒10mL置於lL容量瓶中，用75mmol/LpH7.4磷酸緩衝液定容，即得10mL/L的樣品液。

⑤量取100μLFL稀釋液置於96孔熒光板中，用酶標儀在激發波長490nm、發射波長514nm下測定熒光值(記作‰)。然後，加入不同濃度的TroloX溶液50μL並振搖2min，37℃下孵育8min後立即加入50μLAAPH溶液啟動反應。反應期間，每隔2min便測一次熒光值(記作A_n)，直至熒光值衰減成直線。由下式計算熒光衰退曲線下的麵積(AUC)，計算保護麵積(NetAUC)，然後以NetAUC值為縱坐標，以TroloX溶液濃度為橫坐標，建立標曲。

AUC=0.5×[2×(Ao+A₁+…+A_n+1+A_n)-A_o-A₁]×△t

NetAUC=AUC_sample-AUC_blank

⑥吸取樣品液，按上述方法測定和計算單樅茶酒ORAC值。

二、結果與分析

1、單樅茶酒中兒茶素和GA測定結果

表2為兒茶素和GA標品的標曲方程。由決定係數R²可知方程均擬合良好。

圖1為單樅茶酒中兒茶素和GA的HPLC分析圖譜，表3為計算出的單樅茶酒中的兒茶素和GA含量。
 

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