幾丁質是海洋在自然界中含量僅次於纖維素的天然生物大分子，主要存在於海洋無脊椎動物、细菌酰酶昆蟲的丁质殼及真菌的細胞壁。幾丁質化學結構穩定，脱乙条件溶解性差，发酵導致應用受限。优化幾丁質脫去一定程度的海洋乙酰基得到殼聚糖。殼聚糖含有大量的细菌酰酶遊離氨基和堿性陽離子，溶解性提高，丁质生物相容性好，脱乙条件應用廣泛，发酵導致全球市場上殼聚糖供不應求。优化

目前，海洋殼聚糖的细菌酰酶製備方法有化學法和生物法。化學法利用濃堿熱解處理幾丁質，丁质使其脫去其中的乙酰基，是工業上廣泛使用的方法。但是，化學法產物品質不受控製，並會引起嚴重的環境汙染問題。生物法，反應條件溫和，催化過程易控，而且解決了化學法造成的環境汙染問題，極具應用潛力。但生物法尚未工業大規模利用，原因是其方法應用的瓶頸問題是幾丁質對聚合度較高的脫乙酰酶(Chitindeacetylase，CDA)活性不高。

目前報道的幾丁質脫乙酰酶多產於真菌。真菌幾丁質脫乙酰酶對真菌的營養、真菌細胞壁的合成和完整、芽孢的形成等起到關鍵作用，但是發酵水平較低，難以應用。細菌產幾丁質脫乙酰酶報道較少，且報道的菌株中大部分分泌的幾丁質脫乙酰酶隻催化寡聚幾丁質脫乙酰。海洋微生物豐富多樣，本研究從海洋樣品中篩選幾丁質脫乙酰酶產生菌，對菌株進行鑒定，對發酵條件進行優化，為該菌株的進一步應用奠定基礎。

一、材料與方法

1、材料與儀器

樣品來源：海泥樣品采集於連雲港高公島碼頭；富集培養基：幾丁質2.5g／L、K₂HP0₄0.7g／L、KH₂P0₄0.3g／L、MgS0₄0.5g／L，陳海水配置，pH7.0；平板篩選培養基：幾丁質2g／L、K₂EHPO₄0.7g／L、KH₂P0₄0.3g／L、MgS0₄0.5g/L、對硝基乙酰苯胺0.2g／L、瓊脂20g／L，陳海水配置，pH7.0；種子培養基：蛋白腖5g／L、酵母粉lg／L，陳海水配置，pH7.0；發酵培養基：蛋白腖lOg／L、ZnSO₄0.5g／L、木薯澱粉11g／L，陳海水配置，pH7.9。
SW-CJ-1D超淨工作台：蘇州淨化設備有限公司；分光光度計：杭州明基科學儀器有限公司；SPX-250B-2生化培養箱：上海博迅實業有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海-恒科技有限公司；Nikon90i全電動顯微鏡：上海普赫光電科技有限公司。

2、實驗方法

（1）產幾丁質脫乙酰酶海洋細菌的篩選

初篩：稱取lg泥樣，加入富集培養基，在30℃、180r／min培養72h。取富集培養液100uL均勻塗布於篩選培養基，30℃、培養3～5d，挑取周圍出現明顯黃色圈的菌落，在LB培養基中進一步劃線純化並保存。

複篩：將初篩得到的菌株分別接到種子液中，30℃、180r／min搖床培養24h，再以1％的接種量將種子液接種至發酵培養基中，30℃、180r／min搖床培養72h，取上清為粗酶液並進行酶活力測定和催化α-幾丁質脫乙酰的測定。選取酶活力較高，並能催化幾丁質脫乙酰的菌株進行進一步研究。

酶活性和催化α-幾丁質脫乙酰的測定按照報道的方法進行。酶活單位(U)定義：在上述反應條件下每小時產生對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

（2）菌株MCDA02的鑒定

根據伯傑氏細菌手冊對MCDA02進行形態學及生理生化鑒定。用Axygen試劑盒提取MCDA02的基因組DNA作為PCR擴增模板，16SrDNA通用引物采用27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，反應體係為：PCRmix(12.5μL)，上下遊引物(各lgL)，DNA模板(2μL)，水(9.5μL)。反應程序：94℃變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，32個循環；72℃終延伸10min。PCR產物送至南京思普金公司測序。序列測定後，提交GenBank數據庫並進行BLAST比較分析，利用MEGA7軟件進行同源性分析，構建係統發育樹。

（3）單因素優化菌株MCDA02發酵產CDA培養基

在原發酵培養基的基礎上，保證接種量l％、30℃、裝液量20％、180r／min發酵72h的發酵條件不變，改變培養基中的碳源：葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、豌豆粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、木薯澱粉，氮源：蛋白腖、尿素、牛肉膏、豆粕、玉米漿(幹粉)、米糠、花生粕、麩皮、NaN0₃、NH₄C1、(NH₄)₂S0₄，無機鹽：MgS0₄、CuS0₄、CaCl₂、NaH₂P0₄、KH₂P0₄、MnS0₄、ZnS0₄、BaCl₂、FeCl₃，分別取樣測定酶活力，確定最佳碳源、氮源及無機鹽。

（4）單因素優化菌株MCDA02發酵產CDA發酵條件

確定最佳發酵培養基後，將種子液以l％接種量接種至發酵培養基，30℃、裝液量20％、180r／min發酵96h，每隔12h取樣測酶活力，確定最佳發酵時間；將種子液以1％接種量接種至發酵培養基，裝液量20％、180r／min，在不同溫度下培養72h，取樣測定酶活力，確定最佳發酵溫度；將種子液以1％接種量接種至發酵培養基，30℃、裝液量20％、180r／min，調節發酵培養基不同初始pH，培養72h後測定酶活力，確定最佳培養基起始pH；將種子液以1％接種量接種至不同裝液量發酵培養基，30V、180r／min，培養72h後測定酶活力，確定最佳裝液量；將種子液以不同接種量接種至裝液量為20％的發酵培養基，30℃、180r／min，培養72h後測定酶活力，確定最佳接種量。

（5）響應麵優化菌株MCDA02發酵產CDA發酵條件

根據單因素實驗結果，選取對產酶影響最顯著的三個變量為因變量，進行三因素三水平響應麵實驗設計，優化發酵條件。

3、數據處理與分析

每組試驗設置3組平行，重複試驗3次，試驗結果用平均值±標準方差(n=3)表示，采用Origin2018作圖，響應麵采用DesignExpert10進行統計分析。

二、結果與分析

1、幾丁質脫乙酰酶產生菌的篩選

通過變色圈法總共篩選得到了3株有變色圈的菌株，將這些菌株進行劃線分離純化，保存於斜麵培養基中，置於4℃冰箱保存。將初篩得到的菌株接入種子培養液中，30℃搖床培養24h後，以1％的接種量接入發酵培養基，30℃培養72h，分別測定其酶活力。選取酶活力最高的作為實驗菌株，即為MCDA02。

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