黃曲黴毒素是重组二氫呋喃香豆素的衍生物，是漆酶一類主要由黃曲黴、寄生曲黴和集峰曲黴等產生的降解接分结构解析高毒性的次級代謝產物，具有很強的黄曲致癌、致畸和致突變性。霉毒目前發現20多種AFs，分对其中AFB1、析及AFB2、产物AFG1、重组AFG2為天然毒素，漆酶其他毒素主要由這4種衍生得到，降解接分结构解析已經鑒定得到10多種常見的黄曲AFs結構。其中，霉毒AFB是分对自然界發生的最常見的、毒性最強的析及化學致癌物，被國際腫瘤研究機構劃定為Ⅰ級致癌物質，並且未規定安全劑量。目前，對AFs的脫除方法有物理脫除（物理吸附、擠壓膨化、輻射處理、微波、等離子體降解等）、化學脫除（臭氧、氨氣熏蒸、生物堿、乳酸等）及生物脫除（生物吸附、生物降解等）等方法，前2種方法存在效果不穩定、營養成分損失較大以及難以規模化生產等缺點，而生物脫除法由於過程溫和、無營養物質大量流失及本身和降解生成物不會對人畜造成危害等優點受到學者的廣泛關注並展開了諸多研究。
漆酶（ECI.10.3.2）是一種含銅的氧化還原酶，屬藍多銅氧化酶家族，廣泛分布於自然界的昆蟲、高等植物、真菌（擔子菌、子囊菌和半知菌中較多）和細菌中。漆酶具有廣泛的作用底物，能催化酚類、芳胺類、羧酸類、甾體類及其他一些雜環類化合物發生氧化生成水而不產生有害的過氧化氫和活性氧等中間產物。基於此綠色催化特性，漆酶在工業廢水處理、紡織染料漂白、紙漿木質素去除、土壤和水的生物修複等環境生態領域有非常廣泛的應用，在生物燃料電池、生物傳感器、製藥等方麵的經濟價值也得到飛速擴展和提升。關於漆酶對AFB1降解的研究卻甚少，且主要集中在降解率的測算上，可達到55%～87.34/%，然而對生成的代謝物結構的認識並不明確。
隨著漆酶分子生物學研究的不斷深入，近年來一些真菌漆酶的晶體結構相繼被解析，為進一步揭示真菌漆酶的催化機製提供結構基礎。然而晶體的獲得較為複雜，在某些已知漆酶晶體結構的基礎上同源模建可以最大程度上獲得理想的目的蛋白三維結構，而分子對接技術可以將獲得的三維結構分子逐一放在靶標分子的活性位點處，通過模擬小分子配體與生物大分子受體相互作用，預測其結合模式和親和力。分子對接是探索真菌漆酶酶促降解AFB1規律和機製的重要手段，對於預測漆酶降解AFB1效果有重要的意義，而通過實驗製備理論預測效果好的改性漆酶將進一步明晰其催化和降解機製。本研究通過分子對接模擬漆酶與AFB，的結合模式並用實際降解實驗驗證，利用超高效液相色譜-飛行時間串聯質譜分析降解產物結構，進一步豐富AFs解毒機理等相關理論，為漆酶降解AFB1的可行性提供一定的參考。
一、材料與方法
1、材料與試劑
本實驗所用產重組漆酶LAC3的釀酒酵母菌株由Dr、ThierryTron's實驗室贈送。
三氯甲烷（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純），美國MerdaTechnologyInc公司；AFB，百靈威科技有限公司。
2、儀器與設備
CR22N高速冷凍離心機，日本Himac有限公司；ZWY-200D智誠恒溫振蕩器，上海智誠分析儀器製造有限公司；HPLC-TripleQ-LC-MS，美國Agilent公司；UPLC-Triple-TOF-MS，美國Waters公司。
3、方法
（1）栓菌漆酶的同源模建
漆酶的目的基因序列通過Uniprot數據庫進一步核實，對應的ID為Q6TH77。通過BLAST選擇了蛋白數據庫PDB中ID為3KW7的漆酶作為模板（氨基酸序列相似性均大於65%），采用MOEv2014.0901軟件進行同源模建。在pH7和溫度300K條件下利用LigX優化蛋白質的質子化狀態和氫原子的取向。首先，將目標序列與模板序列比對，並構建10個獨立的中間模型。這些不同的同源模型是不同環候選物和側鏈旋轉異構體的排列選擇的結果。根據GB/VI的打分函數得分最高的被選為最終的模型，使用AMBER12/EHT高壓力場進一步能量最小化。
（2）AFs三維結構繪製
用ChemBioDraw2014軟件繪製AFB1二維結構圖，並通過軟件MOEv2014.0901中的EnergyMinimize模塊進行能量優化，轉換成三維結構。
（3）漆酶與AFB1分子對接
應用軟件MOEv2014.0901中的Dock模塊，預測AFs和同源模建蛋白漆酶的結合能力。在正式對接之前，選擇AMBER12:EHT力場以及R-field隱式溶劑模型。對接流程采用柔性的inducedfit模式，受體結合口袋氨基酸的側鏈可根據配體構象進行優化調整，約束側鏈轉動的權重設置為10。AFs的結合模式首先通過LondondG打分函數進行排序，前30個構象通過進一步力場優化和GBVI/WSAdG方法進行再次評價。采用最佳結合構象模型將配體對接到漆酶的活性位點，根據對接分數、氫鍵作用和關鍵氨基酸位點分析對接結果。
（4）AFs標準溶液的製備
分別準確稱量1mg的AFB1標準品，溶解於1mL色譜級甲醇中，配製成質量濃度為1mg/mL的標準儲備液，並進行梯度稀釋，配製成不同質量濃度的標準工作液用於降解實驗和標準曲線的繪製，-20℃避光保存，待用。
（5）菌株活化及發酵液製備
菌株活化培養基（S-Gal平板）:酵母氮源（YNB，無氨基酸）6.7g/L，酪蛋白氨基酸5g/L，琥珀酸緩衝液50mmo/L（pH5.3），半乳糖6.7g/L，色氨酸40mg/L，腺嘌呤鹽酸鹽80mg/L，硫酸銅100μmol/L，愈創木酚0.02%，瓊脂15g/L。
漆酶發酵培養基（S-Gal）:酵母氮源（YNB，無氨基酸）6.7g/L，酪蛋白氨基酸5g/L，琥珀酸緩衝液50mmol/L（pH5.3），半乳糖6.7g/L，色氨酸40mg/L，腺嘌呤鹽酸鹽80mg/L，硫酸銅100μumol/L。
將菌株轉接到S-Gal平板上，28℃恒溫培養2～3d，進行活化。將產漆酶的釀酒酵母菌株接種到裝有S-Gal培養基的錐形瓶中，置於30℃、160r/min搖床培養4d，進行液體發酵培養。在8000r/min條件下離心30min沉澱菌體，上清液即為漆酶粗酶液，並根據LiuYingli等的方法進行漆酶純化。
（6）漆酶活力檢測
根據呂春鶴等提供的方法並進行改進測定漆酶活力。在30℃、420nm波長下連續監測2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）的氧化速率，在石英比色皿中分別加入pH4.0的0.04mol/LBritton-Robison緩衝液和0.5mmol/L的ABTS溶液，漆酶1min氧化1μmol底物定義為1個活力單位。
（7）漆酶與AFs作用的降解條件
孵育時間對AFs降解率的影響:將酶活力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB1標準溶液渦旋振蕩混勻，置於30℃、200r/min分別孵育12、24、36、48h和60h。對照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的磷酸緩衝鹽溶液（phosphatebuffersaline，PBS），其他條件相同。
孵育溫度對AFs降解率的影響:將酶活力為3U的漆酶與10μL0.1mg/mL的AFB1標準溶液渦旋振蕩混勻，分別置於25、30、35、40℃和45℃溫度下，200r/min孵育12h。對照組為加入同等體積的pH5.7的0.1mol/L的PBS，其他條件相同。
聲明：本文所用圖片、文字來源《中國食品添加劑》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
相關鏈接：黃曲黴毒素，二氫呋喃香豆素，三氯甲烷，並噻唑啉
