4、常压突變株遺傳穩定性驗證
由圖3可知，室温术选隨著傳代次數的等离豆豉增多，突變株NCU—A38、体诱NCU—A17出現了一定程度的变技衰退，產酶能力有所下降，育曲研究集中出現在傳代6次以後，霉型最終在第九代分別下降至696.4 U/g、发酵661.2U/g，菌种下降幅度分別為8.3％、常压7.7％；而突變株NCU—A55和原始菌株經過9代傳代培養後，室温术选中性蛋白酶活分別為739.0U/g ，等离豆豉604.0U／g，体诱僅下降0.4％、变技0.6％，育曲研究下降幅度較小，遺傳穩定性良好。綜合考慮突變株產中性蛋白酶活力及遺傳穩定性，選取突變株NCU—A55進行後續研究。
5、突變株NCU—A55與原始菌株生長性能及產蛋白酶係活力對比
（1）突變株NCU—A55與原始菌株形態觀察
ARTP對微生物遺傳物質造成高度損傷，能在短時間構建大容量突變庫，其遺傳物質的改變一般會體現在表型上。如圖4所示，原始菌株經ARTP誘變後，其菌落形態發生了非常明顯的變化。誘變前，菌落中間凸起，菌落中心孢子分布稀疏，為淡黃色；誘變後的菌落大而平坦，菌落中心孢子分布飽滿，呈黃綠色，顯示出突變菌株具有更快的生長速度。而從圖5可以看出，高倍顯微鏡下觀察到突變株NCU A55菌絲的分化枝點相對原始菌株更多，菌絲繁殖能力更強；低倍顯微鏡下觀察到突變株NCU—A55菌絲的分生孢子頭比原始菌株較多且更密集，產孢子能力更強。這與司曉光研究結果較為一致，其采用AIHP誘變技術選育得到一株高產酸性蛋白酶的突變株B一2，菌絲較原始菌株短，分生孢子頭多，產孢子較快，在固態發酵過程中突變株B一2的生長速率明顯優於出原始菌株。Veerana等人報道，熱效應常壓等離子體誘變通過刺激孢子溶脹、細胞膜去極化、激活鈣和一些萌發相關基因，促進了米曲黴孢子萌發能力的增強。由此看來，突變株生長速度加快，產孢子增多的有利表型不一定是因為ARTP作用於細胞核酸水平的分子結構而引起菌體遺傳物質的改變，進而影響突變株的生長代謝；也有可能是由於ARTP作用改變質膜通透性，使得細胞基質產生大量活性氧等成分進入細胞，與生物大分子相互作用，從而改變大分子構象及活性，進而導致突變株代謝途徑的改變，並有可能會影響到菌體產蛋白酶能力。
（2）突變株NCU—A55與原始菌株產孢子能力對比
如圖6所示，突變株NCU—A55與原始菌株種曲培養基上的產孢子量在60h前並無顯著性差異，但在72～84h時，突變株NCU—A55產孢子量顯著高於原始菌株（P＜0.05），並在72h時，突變株NCU—A55孢子量達到10.25×109CFU/g，較原始菌株提高了39.3％，並達到企業對種曲的使用要求。基於突變株與原始菌株形態對比的基礎上，進一步證實了突變株NCU—A55產生了有利的表型，其產孢子能力較原始菌株顯著增強，有研究表明產孢子能力增強有利於促進蛋白酶的分泌。曹曉梅采用ARTP結合化學誘變手段選育高產阿維菌素的突變株也得到了類似的結果，正突變菌株表現為褶皺多，孢子豐滿，且與目標產物呈正相關。
（3）蛋白酶係對比
由圖7a可知，突變株NCU—A55與原始菌株的中性蛋白酶活力製曲60h前並無顯著性差異，在60～84h時，突變株的中性蛋白酶活力顯著高於原始菌株，並在60h突變株的中性蛋白酶活力最高，達到958.8U/g，較原始菌株酶活力提升了14.7％；由圖7b和7c可知，突變株堿性蛋白酶活力和酸性蛋白酶活力最大值分別出現在製曲60h、72h，達到435.9U/g、109.1U/g，比原始菌株下降13.5％、提升了14.2％。實驗結果與曹小琴利用低能N+離子束注入技術選育醬油釀造用菌米曲黴結果較為一致，其選育的米曲黴突變株蛋白酶活力比原始菌株提高了36％，而本實驗中，采用新型的離子束注入技術，ARTP誘變原始菌株，選育得到的米曲黴突變株其中性、酸性蛋白酶活力均顯著提升，其可能的原因是等離子體中的活性粒子作用於菌株細胞，導致菌株細胞壁和細胞膜的結構及通透性發生改變並引起基因損傷，從而引起菌體一係列的生理變化，擴大了該菌株自身對於碳氮比的需求，但有關堿性蛋白酶活性下降的原因還有待進一步的研究。
三、結論
ARTP誘變米曲黴菌株NCU一110效果明顯，誘變選育得到突變株NCU—A55，淺盤製曲複篩實驗證實其中性蛋白酶活力較原始菌株提升了21.0％，曲醅酶活力達到741.6U/g，遺傳穩定性良好。蛋白酶係對比實驗進一步表明突變株NCU—A55蛋白酶係以中性酶活力為主的特點，且蛋白酶係完整。在製曲60h時中性蛋白酶活力最高，達到958.8U／g，酶活力較初始菌株酶顯著提升14.7％；通過形態觀察及產孢子能力對比，發現突變株NCU A55具有菌絲生長速度快、產孢子能力顯著增強的有利表型。本試驗為米曲黴菌種的改良提供了新思路，為曲黴型豆豉生產提供了一株生長速度快、產中性蛋白酶高活力的優良菌種。後續實驗可進一步探究其高產中性蛋白酶的機理及對原料的利用效率和發酵豆豉的風味、滋味特點。
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