參考Van等、蛋白胡呂霖等模擬消化液配製方法並適當修改,质氧重组具體如表1所示。化和化稱取5g重組魚肉,酶对加入15mL模擬胃液(pH2.0±0.2,草鱼含胃蛋白酶),鱼肉影响37℃恒溫振蕩器消化1h;再加入15mL模擬腸液(pH8.0±0.2,品质含胰蛋白酶),及体37℃恒溫振蕩器消化2h。外模消化結束後100℃水浴5min,拟消待冷卻後加入15mL無水乙醇,蛋白4℃冰箱冷藏過夜後,质氧重组8000×g離心20min,化和化分別留取胃消化後及經過整個消化過程的酶对上清液和沉澱,存於-80℃超低溫冰箱待用,草鱼每個樣品重複3次消化試驗。
參考Fang等的方法並適當修改,分別稱取1g消化前的樣品和1g消化後的樣品,於105℃烘箱,烘至恒重,稱量,幹物質消化率計算公式如下:
式中:W0—消化前的幹物質含量,g;W1—消化後的幹物質含量,g。
參考韋婕妤等的方法並適當修改,取消化前和消化後樣品各5g左右,於烘箱50℃烘至恒重。分別取消化前烘幹樣品和消化後烘幹樣品進行凱氏定氮。蛋白質消化率計算方程如下所示:
式中:DT—蛋白質體外消化率,%;W0—消化沉澱中蛋白質的含量,g;W1—消化前重組魚肉中蛋白質的含量,g。
用BCA試劑盒測定消化後上清液中蛋白質濃度。以全蛋白提取液在562nm下吸光度為空白對照。參考李黎的方法並適當修改,標準曲線配製如下。
用One-wayANOVA進行方差分析和顯著性檢驗,由P<0.05判定存在顯著差異。作圖使用o-rigin8.5軟件。
由圖1可知,羰基含量與氧化時間呈正相關(P<0.05),總巰基含量與氧化時間呈負相關(P<0.05)。羰基含量作為判定蛋白質氧化的主要指標,隨著氧化時間的延長其含量上升,主要因為羥自由基與氨基酸側鏈或肽鏈不斷發生氧化,這與朱文慧等研究結果一致。總巰基含量也常常被認為是判定蛋白質氧化程度的一個指標,蛋白質中的半胱氨酸殘基以遊離巰基形式或氧化的胱氨酸形式存在,當樣品置於氧化體係時,導致總巰基含量下降。由圖1還可知,試驗組羰基含量明顯低於對照組,試驗組的總巰基含量明顯高於對照組,這表明加入TGase會加速蛋白質的氧化,可能是因為加入TGase導致蛋白質結構的改變,從而改變了鐵離子的結合位點,從而使鐵離子和過氧化物靠近,並引發氧化,這與Moreno等研究結果一致。
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