pDNA Listeria的特性值由8個不同的實驗室用UV方法協同測定，檢測結果通過統計檢查以確認每組數據沒有異常值和顯著差異後，细胞將8個實驗室的增生质粒质結果平均值作為該pDNA標準品的特性值。進而參考ISO指南35,特菌根據公式(3)計算質粒DNA在定值過程引入的不確定度(uq):
其中：s為總平均值的標準偏差，p為實驗室數目。考物
pDNA的研制不確定度由三部分組成，分別是单核：由於分裝過程中不均勻性引入的不確定度(uh)、長期保存引入的细胞不確定度(us)、定值過程引入的增生质粒质不確定度(uq)。按照公式(4)計算參考物質的特菌標準不確定度：
計算擴展不確定度時，應將標準不確定度乘以包含因子(k,考物k=2)。所以，研制擴展相對不確定度計按公式(5)計算：
分別對pDNA和從Listeria:H7標準菌株中提取的单核gDNA通過A260進行定量。根據單增李斯特菌基因組大小2.90 Mbp估算gDNA的细胞拷貝數，並基於4 271 bp估算pDNA Listeria的增生质粒质拷貝數。公式(6)用於計算每微升質粒DNA和基因組DNA(gDNA)的拷貝數。
定量完成後，分別使用2×106～2×101拷貝/L的pDNA Listeria和gDNA製備10倍稀釋係列濃度樣品用於進行qPCR檢測。qPCR分析使用ABI SYBR FAST qPCR Master Mix(2×),在八聯管中以25μL體積進行PCR反應(引物序列和擴增子大小見表1),每個反應均含10 pmol/L引物。PCR程序：95℃預變性10 min,95℃變性30 s,55℃退火45 s進行40個循環。根據qPCR結果生成pDNA和gDNA的五點標準曲線。
使用SPSS 16.0和Graphpad 5.0軟件進行統計分析。均勻性測試使用單向方差分析。穩定性分析使用單向線性回歸分析來計算斜率β1,當|β1|
合成了含有hlyA、plcB、inlA基因的DNA片段，並將該片段插入克隆載體pUC57中，製備了重組質粒pDNA Listeria(見圖1)。pDNA經提取純化後，經測序證實，重組質粒中插入片段的序列準確度為100%,符合預期(見圖2)。同時pDNA的A260/A280比值為1.863±0.234,介於1.8～2.0之間，A260/A230的比值超過2.0,表明該pDNA溶液中無乙醇、蛋白質或RNA汙染。
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