副溶血性弧菌是细胞血性学特性一種嗜鹽性弧菌，屬於革蘭氏陰性短杆菌，壁缺該菌大多存在於近海岸的失对生物貝類和海水魚類等水產品中，有時也會出現在醃漬食品中，副溶是弧菌世界上沿海地區引起食物中毒主要的食源性致病菌之一。據估計，影响每年約有7600萬人患病，细胞血性学特性5000人死於食源性疾病。壁缺其中很大一部分歸因於沙門氏菌和副溶血性弧菌。失对生物副溶血性弧菌最早是副溶在1950年日本的一次由沙丁魚引起的大規模食物中毒事件中發現的，之後逐漸在各國的弧菌沿海地區發現，並持續至今，影响已超過沙門氏菌成為世界食源性致病菌之首。细胞血性学特性其感染途徑主要是壁缺食用未完全煮熟的海鮮類食品，進而導致急性胃腸炎，失对生物甚至會使人死亡。同時，副溶血性弧菌也是水生動物弧菌病爆發的病原體，給水產養殖業帶來巨大的經濟損失。深入研究副溶血性弧菌的防控技術，對促進水產品的食用安全和海洋經濟發展具有雙重意義。
由於在臨床治療和水產養殖係統中廣泛使用抗菌劑，副溶血性弧菌中耐藥株的流行日益加劇，50％的臨床和環境分離株具有耐多藥性。自1968年喹諾酮類藥物問世以來，臨床上一直未引入有效對抗革蘭氏陰性菌的新型抗生素同。細菌對現有抗生素已進化出多種對抗機製，如通過主動外排係統增強藥物的外排作用，產生口一內酰胺酶使藥物失去活性，或將藥物作用的靶點加以修飾或改變等等，急需尋找具有新的作用位點且安全有效的替代防治策略。
革蘭氏陰性菌之所以很難找到有效的抑製藥物，主要是因為其細胞的包膜結構較複雜。具有雙層膜結構(位於內側的細胞質膜稱為內膜，細胞壁最外層的膜稱為外膜)。在兩層膜間為肽聚糖層。與外膜共同構成細胞壁。外膜是革蘭氏陰性菌的特有構造，具有典型的不對稱性磷脂雙層結構，由脂多糖、磷脂和外膜蛋白構成。一直以來，細胞與外界環境的物質交換部位主要關注的是細胞質膜，近10年間研究人員才開始關注外膜，尤其是外膜蛋白在物質穿膜過程中的作用。外膜蛋白包括連接外膜層與肽聚糖層的脂蛋白和跨外膜的孔蛋白。單體孔蛋白由8～22個偶數跨膜鏈以反向平行方式通過相鄰鏈間的氫鍵作用形成β-桶狀結構。跨膜鏈的數量決定孔蛋白的拓撲結構，從而導致孔徑的不同。孔蛋白可以選擇性地吸收各種營養物質，同時也能阻攔多種有害大分子物質進入細胞。在去掉細胞壁的大腸杆菌原生質體中，胞內高積累化合物與胞內低積累化合物之間的積累差異明顯變小，這一結果證實外膜是小分子在革蘭氏陰性菌中化合物積累的主要障礙啊。吳賢斌等曾將大腸杆菌外膜孔蛋白OmpW去除，發現缺失株對硫酸新黴素和氨苄青黴素的敏感性明顯增加。與親本株相比，在大腸杆菌孔蛋白OmpF/OmpC缺失株中觀察到高積累藥物積累量顯著降低。說明小分子穿過外膜主要通過孔蛋白同。以上研究結果均顯示，細胞壁尤其是外膜對於革蘭氏陰性菌的生存是必不可少的，而去除細胞壁或是外膜對於革蘭氏陰性菌可能是致命的。
肉桂醇是我國《食品添加劑使用衛生標準》中允許使用的食品香料。被證實對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑菌效果
Mazzarrino等針對腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌篩選出21種有抑菌活性的精油，發現肉桂的抑菌效果是有效的。目前關於肉桂醇對副溶血性弧菌的抑製作用及機理的研究尚未見報道，本文采用肉桂醇作為抑菌劑探究細胞壁的缺失對副溶血性弧菌生物學特性的影響。明確肉桂醇的作用靶點，為副溶血性弧菌的防控提供試驗依據。
副溶血性弧菌保存於-80℃超低溫冰箱中。
3％氯化鈉堿性蛋白腖水(APW)、營養瓊脂，北京奧博星生物技術有限責任公司。以上培養基均121℃滅菌20min。
肉桂醇、Tris、EDTA、硫酸粘杆菌素、十二烷基肌氨酸鈉(SLS)、SYBRGreenI、PI，生工生物工程(上海)股份有限公司；溶菌酶、馬來酸鹽，合肥博美生物科技有限責任公司：考馬斯亮藍G-250。天津市福晨化學試劑廠；蔗糖、氯化鎂、磷酸二氫鉀、乙醇，天津市天力化學試劑有限公司；磷酸、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉，天津市風船化學試劑科技有限公司：常用藥敏試紙，杭州濱和微生物試劑有限公司；牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司。
ZD-85A氣浴恒溫振蕩器，金壇市科析儀器有限公司；真空幹燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；G154DS型自動蒸汽壓力滅菌鍋，廈門致徽儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機，Eppendorf中國有限公司；Czone5F自動菌落計數儀，杭州迅數科技有限公司；perkinelmerv3酶標儀，成都必成豐瑞生物技術有限公司：UV-2550紫外-可見分光光度計。日本島津公司：Scientz-IID超聲波細胞粉碎機。寧波新芝生物科技股份有限公司；SDS電泳係統、GelDocXR+凝膠成像儀，美國BIO-RAD有限公司；AccuriC6Plus流式細胞儀，BD生物科學北京卓越中心。
將副溶血性弧菌按1％的接種量加入APW中。37℃、130r/min培養12h，連續培養2代。
參考Xu等的方法製備副溶血性弧菌原生質體。將活化的菌液置於4℃、6000r/min離心收集菌體細胞。用0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)洗滌3次。細胞重懸於含有0.5mol/L蔗糖的0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)中，緩慢加入EDTA溶液(pH8.0。20min之內完成此步)至其終濃度為0.01mol，L。37℃、100r/min振蕩20min，獲得一組除去外膜層的細菌細胞，留此階段部分菌體冷藏備用。另一部分菌體在4℃、3000r/min離心收集細胞，用SMM緩衝劑(20mmol/L馬來酸鹽、0.5mol/L蔗糖、20mmol/LMgCl2，pH6.5)清洗2次，細胞重懸於SMM緩衝劑(含1mg，mL溶菌酶)中，37℃、100r/min振蕩30min，除去肽聚糖層，緩慢滴加EDTA溶液(pH8.0)使其終濃度為0.01mol/L，放入37℃的培養箱溫育15min。獲得一組去壁的細菌細胞，將此原生質體冷藏備用。未處理的菌體同樣冷藏備用。
采用二倍稀釋法處理肉桂醇原液(質量濃度為1g/mL)，使其質量濃度依次為原液的1/2至1/2048。試管內物質組成為8.9mLAPW、1mL菌液(分別為UG、OMDG和CWDG)和0.1mL不同質量濃度的肉桂醇溶液。所有試管置於37℃培養24h後觀察菌體生長情況，使培養液保持澄清的最小藥物質量濃度即為肉桂醇對副溶血性弧菌的最小抑菌濃度(MIC)。
參考張讚彬等的方法，將菌懸液在4℃、3000r/min條件下離心15min收集菌體，磷酸緩衝液(pH7.0)清洗並重懸。向新的離心管中加入10mL菌懸液和45仙L肉桂醇(1/4MIC、1/2MIC、MIC、空白)，37℃培養6h，在6000r/min下離心3min收集上清液。在波長260nm處測定其吸光度值，即為菌液中核酸的含量。同時采用考馬斯亮藍法對上清液中的蛋白質進行染色，測定其在波長280nm處的吸光度值，即為菌液中蛋白質的含量。
考Richter等的方法並適當修改，先向96孔板每孔中加入20μL硫酸粘杆菌素溶液(6μmol/L)和178μL稀釋好的菌懸液，靜置30min，再加入不同質量濃度的肉桂醇(1/4MIC、1/2MIC、MIC、空白)2μL，混勻並置於37℃培養18～24h後用酶標儀測定其在波長280nm處的吸光度值。
參考Chiu等的方法進行外膜蛋白的提取，並稍作修改。在4000r/min、4℃條件下收集細胞，經4℃生理鹽水洗滌3次。重懸於少量體積的鹽水中。利用超聲波細胞粉碎機進行細胞破碎處理(300W、冰浴5min)，間歇10次完成。在5000r/min、4℃條件下離心20min，收集上清：於15000r/min離心40min，沉澱重懸於2g/100mLSLS中並在室溫條件下孵育1h後，於15000r/min離心40min，沉澱即為外膜蛋白。
利用考馬斯亮藍法(Bradford法)測定獲得的外膜蛋白質量濃度。首先利用標準蛋白溶液繪製標準曲線，如圖1所示。測定波長595nm處外膜蛋白樣品的吸光度值。根據標準曲線公式計算出外膜蛋白的質量濃度。
采用非連續緩衝係統垂直板電泳，選用12％分離膠，5％濃縮膠。外膜蛋白樣品沸水浴5min，加樣量為20μL[16μL蛋白溶液+4μL(5×)蛋白上樣緩衝液]，80V電壓進行樣品濃縮，樣品進入分離膠後加壓至120V，當溴酚藍即將跑出膠板時，停止電泳。膠板考馬斯亮藍染色後置於凝膠成像係統拍照。
考Lam等的方法進行外膜蛋白競爭試驗，並作一定的改動。將50μL肉桂醇、50μL外膜蛋白(質量濃度在2～512μg/mL)加入96孔板中，37℃下孵育1h。之後向每孔中加入100μL副溶血性弧菌懸液(約2.5×106個/mL。使肉桂醇終質量濃度為1/2MIC)，37℃下孵育2h。各孔中取出50μL混合培養液，轉移至第2個96孔板中，並加入100μL鹽水和染料混合物(即含有0.1％SYBRGreenI和0.1％PI的鹽水)，用流式細胞儀分析第2個96孔板中的各孔，確定細胞凋亡情況。
參考李莉等的方法，向100mL營養瓊脂培養基中分別加入500μL處理好的菌液(包括UG、OMDG、CWDG)，混勻後倒平板，待培養基凝固後向每個平板中放入3片相同的藥敏試紙(包括四環素、紅黴素、萬古黴素、環丙沙星、利福平)，所有平板置於37℃培養18～24h，測量抑菌圈直徑。
數據處理采用Excel2010並繪製圖表，利用SPSS19.0對所有數據進行差異顯著性分析，所有試驗均重複測定3次，測定結果表示為平均數±標準差。
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