為了篩選產生吡咯喹啉醌，吡咯英文名為pyrroloquinoline quinone（PQQ）的喹啉醌产菌株並提高PQQ發酵產量，該研究建立了一種快速的生菌高效液相色譜法檢測PQQ，並采用了以甲醇為唯一碳源的选和選擇性培養基，利用光譜法對樣品進行初篩，菌种鉴定高效液相色譜法（HPLC）對初篩得到的吡咯結果再進行複篩。該研究還對篩選得到的喹啉醌产菌株發酵產PQQ的培養基進行了優化。研究結果顯示：從樣品中篩選得56株PQQ產生菌，生菌搖瓶產量最高的选和一株為20.6 mg /L，通過16s rDNA 測序分析，菌种鉴定鑒定該菌株為Methylopila sp.屬。吡咯對培養基成分中的喹啉醌产碳源甲醇進行了優化研究，當甲醇體積濃度為2.5%時，生菌PQQ產量最高，选和為26.3 mg /L，菌种鉴定相比於初始甲醇1.0%提高了28%。該研究建立的高效液相色譜法為PQQ高產菌株的篩選提供一種快速檢測方法，篩選到的菌株具有較高的甲醇耐受力和PQQ生產潛力，為之後的PQQ發酵研究提供參考。

吡咯喹啉醌，英文名為pyrroloquinoline quinone（PQQ），作為許多細菌脫氫酶（甲醇脫氫酶，乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶等）的輔助因子於1964年首次被發現，它是繼吡啶核苷酸和核黃素之後的第三種氧化還原酶的輔酶。PQQ在生物界的分布極為廣泛，在動植物和微生物細胞中均發現其存在，但僅有部分革蘭氏陰性細菌能合成PQQ。

在具有合成PQQ能力的細菌中，絕大部分隻能合成痕量的PQQ以供給細胞生長，隻有少部分可以生產過量的PQQ，並將其排泄到培養基中，其中以甲基營養菌的合成能力最強，如甲基菌屬（Methylobacill），甲基單胞菌屬（Methylomonas），嗜甲基菌屬（Methylophilus）和甲基杆菌屬（Methylobacterium）等。此外，在納豆，青椒和獼猴桃等植物體內也含有微量的PQQ，並且牛奶和人類的母乳中也存在較高濃度的PQQ。近幾十年來的研究發現PQQ具有多種生理功能，它是許多細菌脫氫酶的輔助因子，參與細胞的電子呼吸鏈傳遞；PQQ可以提高微生物細胞的抗逆性，並提高宿主菌的抗氧化能力[18]；PQQ還是動植物刺激或生長因子；此外，PQQ與葡萄糖脫氫酶結合形成PQQ-GDH全酶，可用作檢測葡萄糖的生物傳感器，也可用作生物燃料電池。

由於目前PQQ化學合成步驟複雜，副產物多，而微生物發酵生產PQQ成本低，步驟少，產物分離更容易，因此微生物發酵法成為最有前景的工業化生產路線。雖然對PQQ的研究已有幾十年，但其生物合成的具體過程尚未完全闡明，從環境中篩選高產野生菌依然是必不可少的。1992年，URAKAMI等篩選到一株PQQ產生菌，經鑒定為生絲微菌Hyphomicrobium sp.TK0441，優化培養基後在30 L發酵罐上發酵14天後PQQ產量可達到1 g/L。司振軍等[22]從土壤中篩選到一株甲基營養菌，經鑒定為Methylobacillus sp.zju323,未經優化的PQQ搖瓶產量為23.2 mg/L，在已報道的研究中屬於高水平。本研究建立了一種高效液相色譜法用來快速檢測PQQ，並從土壤樣品中篩選得到一株PQQ高產菌，並對其進行了菌種鑒定和培養基優化，為後續進行PQQ的進一步生產研究提供依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

細菌樣品來自於無錫生產甲醇工廠附近的土壤和汙水。PQQ標準品購自於Sigma公司，其他試劑均購自於國藥集團。

1.2儀器與設備

G180T滅菌鍋，美國致微儀器有限公司；高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司；酶標儀，美國BioTek公司；Agilent-1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司。

1.3培養基

篩選培養基：甲醇30 mg /L，(NH4)2SO4 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L ，KH2PO4 1.4 g/L，微量元素液 1 mL/L。固體培養基添加2%的瓊脂粉。

種子培養基：甲醇10 mg /L，(NH4)2SO4 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 1.4 g/L，微量元素液 1 mL/L。微量元素液：CaCl2·2H2O 30 mg/L，MnCl4·4H2O 5 mg/L發酵培養基：在種子培養基的基礎上加入1 mL維生素液，維生素液配方（mg/L）：核黃素200，對氨基苯甲酸200，鹽酸硫胺素400，煙酸400，鹽酸吡哆醇400，泛酸鈣400，葉酸2，生物素2，肌醇2000。

1.4實驗方法

1.4.1 PQQ產生菌初篩方法的確立

光譜法：對PQQ標準品進行全波長掃描，發現其在249 nm和330 nm處有兩個吸收峰，將200 μ L PQQ標準品溶液或發酵離心上清液轉移至96孔板中，用酶標儀檢測 OD330與 OD249，並將空白培養基以同樣的條件處理和檢測，從而減去培養基吸光值的幹擾。

1.4.2 HPLC法檢測PQQ

由於PQQ的結構上連有3個—COOH，因此其易溶於水，極性較大，在普通的C18反相色譜柱上不保留。目前采用較多的是離子色譜對法來檢測PQQ，但是離子色譜對平衡時間長，操作複雜且對柱子也有局限性；還有采用加酸調節pH來使PQQ保留在色譜柱上，但這使得峰形拖尾嚴重並且重現性不好。為此本實驗選擇親水色譜柱來解決PQQ難以在色譜柱上保留的問題。以水為流動相，通過COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色譜柱，測定PQQ在249 nm和330 nm的吸光值，根據出峰麵積確定其濃度。利用安捷倫1260係列高效液相色譜儀測定PQQ含量，進樣量20 μ L，溫度30 ℃，流動相為0.05 mol/L乙酸：0.05 mol/L乙酸銨=30：70，流速1 mL/min，在波長249 nm和330 nm下檢測PQQ標準品和樣品含量。

1.4.3菌株的篩選

將樣品製成適當濃度梯度的稀釋液，塗布於甲醇篩選培養基平板上，30 ℃培養3~5天，分別挑取不同形態的單菌落接種到種子培養基中，30 ℃，200 r/min 培養3~5天，將發酵液離心取上清液，用光譜法快速檢測PQQ含量，再用HPLC法對PQQ產量較高的菌株進行複篩。

1.4.4菌種的鑒定

將PQQ產量最高的菌株在固體培養基上劃線，30 ℃培養3~5天，利用普通光學顯微鏡觀察菌體形態特征。取單菌落接種到搖瓶培養基中，30 ℃培養，當菌體OD600為0.5~1時，取3 mL發酵液，10000 r/min離心1 min，棄去上清液，收集菌體，按照細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取DNA，利用細菌通用引物 27F：5'-AGA GTT TGA TCM TGGCTC AG -3'；1492R：5' -GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3'，通過 PCR 反應擴增該菌株的16s rDNA序列，將產物委托上海生工測序，將測序結果在NCBI網站中進行BLAST比對，用軟件MEGA進行係統進化樹的構建。

1.4.5甲醇含量對菌體生長和PQQ產量的影響

對培養基中的唯一碳源甲醇進行優化，研究甲醇的不同添加體積濃度（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）對菌體生長和PQQ產量的影響。

2結果與分析

2.1光譜法檢測PQQ

研究建立了基於光譜法檢測PQQ的快速篩選方法，通過全波長掃描發現PQQ在249 nm和330 nm左右有兩個吸收峰。考慮到發酵液中含有蛋白，核酸等在249 nm左右有吸收值的物質，而在330 nm處有吸收值的物質較少，因此，本實驗選擇研究PQQ濃度和OD330的關係。通過酶標儀檢測不同濃度 PQQ標準品的OD330（檢測樣品時要減去空白發酵培養基的吸光值以除去幹擾），發現在330 nm下PQQ濃度與OD330關係為y=0.0218x-0.0354 (R2=0.9957)。當PQQ濃度在2.5~50 mg/L之間時，二者呈現良好的線性關係，由於野生菌產PQQ量多在1~20 mg/L左右，因此使用本方法進行高通量篩選的初篩具有良好的可行性。

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