單核細胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）是单核食品中重要的致病性微生物，也是细胞性单李斯特菌屬內能引起腸胃炎、敗血病、增生珠的制备腦膜炎和李斯特菌病等最主要的李斯链抗病原體，致死率達30%，特菌特异体磁對免疫缺陷人群危害嚴重。单核該菌廣泛存在於乳製品、细胞性单肉製品、增生珠的制备蔬菜水果和海產品等各類食品中，李斯链抗能在pH4.0、特菌特异体磁高鹽和4℃環境中存活並繁殖。单核
單核細胞增生李斯特菌的细胞性单生長易被其同屬內的其它細菌（如英諾克李斯特菌等）掩蓋，較難在培養後分離獲得目標菌，增生珠的制备導致假陰性檢測結果。李斯链抗免疫磁珠捕獲技術（Immuno-magneticbeadstechnology，特菌特异体磁IMBs）可在複雜體係中特異性地捕獲目標微生物，獲得活菌體。IMBs的特異性依賴於所用抗體的性能，而抗體受製於生產工藝，其質量與產量都不穩定。與傳統免疫血清、雜交瘤等抗體製備技術相比，噬菌體展示技術（phagedisplaytechniques）通過噬菌體庫與目標菌的特異性結合，篩選獲得高特異性的表麵單鏈抗體片段（single-chainantibodyfragments，scFvs）。將表達特性蛋白的基因轉移至質粒內，可穩定保存並大規模生產具有相同特性的單鏈抗體。
前期有研究報道一種對單核細胞增生李斯特菌具有高特異性的噬菌體展示單鏈抗體片段的製備方法。本研究基於該片段的特異性，製備親和素偶聯的scFv免疫磁珠（scFv-IMBs）。通過在多種增菌培養體係中的定性、定量檢測，考察scFv-IMBs對不同李斯特菌屬細菌的特異性捕獲情況，評價scFv-IMBs在人工汙染的法蘭克福香腸中分離單核細胞增生李斯特菌和英諾克李斯特菌的能力。
試驗使用了14株單核細胞增生李斯特菌和9株其它李斯特菌屬細菌（表1）。菌種複蘇於腦心浸液（BHI）培養基（BDDiagnostics，Sparks，MD）中，置37℃振蕩培養過夜，振蕩速度為250r/min。選擇RAPIDL.MonoAgar（Bio-Rad，CA）作為李斯特菌顯色培養基，該培養基上單核細胞增生李斯特菌顯藍紫色，伊氏李斯特菌顯藍綠色，英諾克等其它李斯特菌顯白色。市售李斯特菌免疫磁珠Dynabeadsanti-Listeria（Dyna-IMBs），購自ＴhermoScientific。
按已報道的方法采用含pBAD：A8質粒的大腸埃希菌（E.coliAＶB100）製備生物素標記的scFv抗體。以含0.3%的L-阿拉伯糖和1mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPＴG）進行誘導培養，用弗氏細胞破碎儀獲得裂解液，經離心、層析和過濾純化得到含生物素標記的scFv清液。
取鏈黴親和素標記的DynabeadsM280磁珠100μL（ＴhermoScientific），加入PBS緩衝液（20mmol/L磷酸鹽，150mmol/LNaCl，pH7.4）900μL，混勻。置磁力架上振搖收集磁珠，棄去液體。將磁珠分散於含0.1%牛血清蛋白的PBS緩衝液（以下簡稱PBS緩衝液）中活化。取約10μg生物素標記的scFv抗體，加入活化的磁珠體係中（濃度約為7×109～9×109個/mL），室溫振蕩1h。在磁力架上穩定3min，用PBS緩衝液反複清洗4次，分散於1mLPBS緩衝液中，製備成scFv結合的免疫磁珠（scFv-IMBs），置4℃保存。
DNA提取選用DNeasyBloodandＴissueKit試劑盒（QIAGEN，Maryland，US），按說明書操作。DNA溶解於100μLＴE緩衝液中，-20℃保存。
從5對備選李斯特菌特異性PCR引物（表2）中篩選單核細胞增生李斯特菌特異性擴增引物。
反應體係為：模板溶液1μL，DNA聚合酶1U（GoＴaqDNApolymerase，Promega，WI），1×PCR緩衝液，MgCl2濃度1.5mmol/L，dNＴP濃度各0.25mmol/L，上下遊引物各50nmol/L，加純水至25μL。用iQ5實時熒光定量係統（Bio-Rad，CA），反應條件為95℃預變性5min；95℃變性30s，51℃退火40s，72℃延伸40s，共30個循環；最後72℃延伸5min。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物6μL，在150Ｖ電壓的1×ＴAE緩衝液（Ｔrisacetate-EDＴAbuffer）中電泳20min，用10μg/mLEB染料（ethidiumbromide）染色15min後，置紫外凝膠成像儀（MultiImageLightCabinet，Alphalmager）觀察。標準DNA分子質量采用ExactGene（lowRangeDNAladder，FisherBioReagents，NY），以單核細胞增生李斯特菌AＴCC19115基因組DNA為陽性對照，純水為空白對照。
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