放射免疫分析(radioimmunoassay，农药RIA)是残留由Yalow R·S·和Berson S．A．於1954年創建的。該法利用放射性同位素(常用3H、酶的免125I、活性32P等)標記抗原或抗體，抑制疫分通過檢測放射性強度對抗原或抗體進行示蹤和檢測，免疫具有檢測靈敏度高(檢測限達ng至pg甚至fg級)、分析特異性強、技术簡便實用的析法優點。但放射性同位素標記要在特殊的农药實驗室中進行，標記較困難，残留標記和分析中易造成放射性汙染。酶的免此外，活性由於放射性元素有一定半衰期，抑制疫分易自行衰減且難以保存，免疫檢測時需要特殊的儀器設備，在農藥殘留分析中的應用受到很大限製，甚至趨向於被淘汰。
酶免疫分析法(erzyme immunoassay，EIA)是Engrall等人於1966創建的。該法用特定的酶(如過氧化物酶、堿性磷酸酯酶等)來標記抗原或抗體，利用抗原抗體反應的特異性和酶催化顯色反應的高效性對抗原抗體反應進行示蹤和檢測。常用酶免疫分析包括酶抑製法(erlzynle inhibition，EI)、酶放大免疫檢測法(enzyme—multipledimmlmoassay techniqtle，EMIT)和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。
(1)酶抑製法：此法利用特定的酶標記抗原或抗體，酶標記物在形成抗原抗體複合物時，酶活性降低，通過測定酶活性的變化對抗原抗體反應進行檢測。酶抑製法是一種均相免疫分析方法，方法簡便，既可以用於檢測抗體，也可以用於檢測抗原，但其靈敏度較低。
(2)酶放大免疫檢測法：此法將酶標記農藥半抗原、待測農藥及抗體加入反應管進行競爭結合反應，離心去除結合物，上清液中剩餘的酶標農藥半抗原量與待測農藥含量呈正比。
在上清液中加入酶的底物和顯色劑，酶促顯色反應強度與待測農藥含量呈正比。酶放大免疫檢測法不用固相載體，重複性好，檢測速度快。
(3)酶聯免疫吸附測定法：酶聯免疫吸附測定法是將抗原抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合的一種敏感性很高的非均相免疫分析技術。將抗原或抗體固定於固相(如聚苯乙烯微孔板表麵)，抗原抗體反應平衡後，洗滌除去多餘的遊離物，結合在固相上的酶標記物催化底物反應使顯色劑顯色，通過測定酶促顯色強度對抗原抗體反應進行檢測。在實際應用中，檢測大分子抗原多采用雙抗體夾心等非競爭模式。檢測農藥、藥物等小分子采用間接競爭酶聯免疫吸附測定法、包被抗原直接競爭酶聯免疫吸附測定法和包被抗體直接競爭酶聯免疫吸附測定法。
目前已建立了多種有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等農藥的酶聯免疫吸附測定法，有些已開發成商品化免疫檢測試劑盒。酶聯免疫吸附測定法是目前應用最多的農藥殘留免疫分析技術。
熒光免疫分析(fluorescerlce immurtoassa3r，FIA)包括熒光標記免疫分析和酶標記熒光免疫分析。熒光標記免疫分析是用特定的熒光物質標記抗原或抗體，利用抗原抗體反應的特異性和熒光檢測的高敏感性對抗原抗體反應進行示蹤和檢測。經典的熒光免疫分析以有機熒光分子為標記物，常用的有異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocya-nate，FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rh(Marnine isothic)cyanate，TRITC)等。酶標記熒光免疫分析是在酶標記免疫分析中用熒光底物代替生色底物，是目前非放射免疫分析中靈敏度最高的方法之一。
熒光免疫分析具有靈敏度高、易標記、好保存等優點。但是大多數有機熒光物質的熒光壽命短，在實際應用中由於樣品、試劑的自身熒光和激發光的散射等因素，導致背景熒光高，影響了測定的可靠性和靈敏度。
(1)非競爭模式：熒光免疫分析法檢測抗體、顆粒性或大分子抗原通常采用非均相反應和非競爭方式，檢測方法和原理如下。
①直接法：先固定待測物(含抗原或抗體的樣品)，加入熒光標記抗體(或熒光標記抗原)，進行免疫反應。洗滌去除遊離物後進行熒光檢測。如固相上結合了熒光標記抗體(或熒光標記抗原)，表明固相上有相應的特異性抗原或特異性抗體存在，且熒光強度與相應抗原或相應抗體的量在一定範圍內呈正比。
②雙抗體夾心法檢測抗原：先固定抗體，加入待測物進行反應。洗滌去除遊離物後加入熒光標記的第二抗體。洗滌去除遊離物後進行熒光檢測。如固相上結合了熒光標記物，表明有相應的特異性抗原存在，且熒光強度與待測抗原量在一定範圍內呈正比。
(2)競爭模式：農藥等小分子化合物的熒光免疫分析通常采用競爭模式，檢測方法和原理如下。
①熒光偏振免疫分析：熒光偏振免疫分析(fluorescence polarization immulaoassay，FPIA)是一種利用物質分子在溶液中旋轉速度與分子質量大小呈反比的特點檢測目標分析物的方法。以適當的熒光物質標記農藥半抗原，當熒光標記物受到一個平麵偏振光照射時，如果分子的長軸與投入的偏振光麵平行，吸收的偏振光最多，分子被激發。當激發態分子回到基態時，發射一個偏振光。熒光標記物在溶液中旋轉速度越快，發射的偏振光越弱。由於分子旋轉的速度與分子質量大小呈反比，因而偏振光減弱的程度與分子旋轉的速度呈正比。當熒光標記農藥與相應抗體結合後，分子質量顯著變大，旋轉速度明顯減慢，偏振光增強。當待測溶液中有目標分析農藥存在時，目標分析農藥與熒光標記農藥競爭結合抗體，使熒光標記農藥與抗體的結合減少，偏振光減弱，減弱的程度與待測農藥的濃度在一定範圍內呈正比。
②以熒光增強和熒光猝滅為基礎的免疫分析：該法利用抗原抗體反應過程中熒光標記物或熒光底物發生熒光增強或熒光猝滅作用來檢測抗原或抗體。
熒光偏振免疫分析、以熒光增強和熒光猝滅為基礎的免疫分析通常是均相免疫分析，方法簡便快速、經濟安全，但背景的幹擾限製了方法的靈敏度。
③時間分辨熒光免疫分析：時間分辨熒光免疫分析(tlmeresolution fluorescencc、immunoassav，TRFIA)以鑭係元素螯合物為熒光標記物或熒光底物，利用標記的TRFIA物或底物的熒光壽命較長的特點，在背景熒光消失後測定標記物或底物的熒光強度，可有效降低背景熒光的幹擾，顯著提高熒光免疫分析的靈敏度，是20世紀80年代免疫分析的一個重要突破。
化學發光是利用化學反應過程中產生的內能激發化學發光劑(常用魯米諾及其衍生物)發光。化學發光免疫分析(chemilumirlescence lmmunoassay，CLIA)是把化學發光的高靈敏度與免疫分析的高選擇性結合起來的微量免疫分析技術，包括化學發光標記免疫分析、酶標記化學發光免疫分析(底物發光免疫分析)等。
(1)化學發光標記免疫分析：化學發光標記免疫分析的原理和反應模式與放射免疫分析基本相同，隻是用化學發光劑代替同位素標記抗原或抗體。化學發光劑標記的抗原或抗體與待測抗體或待測抗原反應後經分離、洗滌等步驟，最後通過測定發光強度來確定待測物的含量。
(2)酶標記化學發光免疫分析：酶標記化學發光免疫分析的原理和反應模式與酶聯免疫吸附測定法基本相同，隻是用化學發光劑代替顯色劑，以檢測化學發光代替比色測定。
化學發光免疫分析的檢測靈敏度可以與放射免疫分析媲美，方法簡便快速。目前，化學發光免疫分析存在的主要問題是被測樣品中其他物質的背景幹擾大，影響定量測定結果的準確度。
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