以多巴（L-DOPA）為底物，柚皮測定酪氨酸酶的苷氢活性。先將待測樣品用無水乙醇溶解，抗氧配製成質量濃度為1Mg/ML的化活貯備液，再依次稀釋成不同濃度的性研樣品溶液。按表2所示，柚皮依次準確吸取不同濃度的苷氢樣品溶液，pH6.8的抗氧0.5MoL/L磷酸鹽緩衝溶液，0.5MMoL/LL-DOPA溶液和0.15Mg/ML酪氨酸酶溶液，化活充分混勻，性研在37℃水浴鍋中孵育反應30MiN，柚皮然後立即測定各試管中反應溶液在475NM處的苷氢吸光值。上述試驗均重複3次。抗氧根據酶反應活性的化活定義，在一定的性研抑製劑濃度下，酶反應活性表示為ACTi，在沒有抑製劑時酶反應活性表示為ACT0，則受試樣品對酶的相對抑製率（I）可以定義為：
 

式中，ACTi—有抑製劑時的酶反應活性；ACT₀—沒有抑製劑時的酶反應活性；A₁，A₂，A₃，A₄—1，2，3，4號反應液的吸光值。

1.2.7 B16黑色素瘤細胞細胞MTT試驗

稱取50g重鉻酸鉀固體，以100ML蒸餾水100℃溶解（電爐加熱），快速加入900ML濃H₂sO₄，混勻，冷卻即可使用。MTT用PBs配製成質量濃度5Mg/ML，過0.22μM水相濾膜後存於10ML無菌離心管中，於-20℃冷凍保存。具體步驟：

1）取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果苷的標準品

20Mg，加入DMsO溶解配成500MMoL/L的母液，過0.22μM有機濾膜後以每管20μL分裝於無菌的200μL離心管中，於-20℃冷凍保藏。

2）不同濃度樣品的配製

分別取柚皮苷、NariNgiNDC和熊果苷3種物質500MMoL/L的母液各4μL，加入4ML1640基礎培養基中，配成500μMoL/L的溶液，然後分別稀釋到250，125，62.5μMoL/L3個濃度。

3）96孔細胞培養板培養細胞

在超淨工作台中移取5ML75T細胞培養瓶終止消化後的細胞與培養液的混合液於離心管中，800r/MiN離心4MiN，棄上清液，移取3ML完全培養基於離心管並混勻細胞液，取上述1ML細胞液，加1ML完全培養基，取80μL於平板計數器計數，用完全培養基稀釋調整細胞濃度為8000個細胞/100μL，用12通道移液槍將細胞液混勻，加入96孔細胞培養板，每孔加入100μL，做好標記後將細胞培養板放入CO2恒溫培養箱培養24h。

4）96孔細胞培養板中加入樣品

將上述96孔細胞培養板放入CO2恒溫培養箱培養24h，用廢液真空泵吸棄細胞培養液，每孔加入不同濃度的樣品150μL，並且每塊96孔板都要留1到2列隻加基礎培養基做空白對照，做好標記後將細胞培養板放入CO2恒溫培養箱培養24h。

5）B16黑色素瘤細胞的MTT試驗

在超淨工作台中，取PBs配成質量濃度5Mg/ML的MTT溶液，與基礎培養基以體積比1∶9的比例配成MTT細胞培養液。將步驟4）中加樣品培養24h後的細胞培養液用廢液真空泵吸棄，每孔加入150μLMTT細胞培養液，做好標記後將細胞培養板放入CO2恒溫培養箱培養4h，吸棄MTT細胞培養液，每孔加入150μLDMsO，於酶標儀中振動10MiN後測定波長490NM處的吸光度值。

細胞存活率=（A₀-Ax）/A₀×100%

式中，A₀—不加樣品的空白吸光度值；Ax—加不同濃度樣品作用後的吸光度值。

1．2.8 B16黑色素瘤細胞HoeChsT熒光染色試驗

具體操作步驟：

1）於超淨工作台上，打開六孔板，置滅菌蓋玻片。將細胞懸液滴加至蓋玻片上，置CO2體積分數為5%的培養箱中，37℃培養至細胞固著（約2h），加入2ML細胞培養液繼續培養約6h。棄培養基，用PBs洗3次，每次5MiN。

2）用4%多聚甲醛固定30MiN，PBs洗3次，每次5MiN。

3）切片稍甩幹後在圈內滴加適量HoeChsT染液到爬片上，室溫避光孵育15MiN。

4）PBs漂洗爬片3次，每次5MiN，從六孔板內取出爬片，將有細胞的一麵封到滴加有抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，熒光顯微鏡下觀察並拍照。

1.2.9 NariNgiNDC與雙孢蘑菇酪氨酸酶的分子對接

采用CheMBioDrawULTra14.0畫出化合物熊果苷和NariNgiNDC的結構，然後用CheMBio3DULTra14.0轉化為三維結構，用MMFF94力場進行優化。雙孢蘑菇酪氨酸酶的三維結構（PDBiD：2Y9X）從RCsB蛋白數據庫下載。酪氨酸酶和化合物均使用AuToｄoCkTooLs1.5.6轉化為PDBQT格式。采用AuToｄoCkviNa1.1.2進行分子對接。酪氨酸酶活性位點的坐標設置為：CeNTer_x=-10.044，CeNTer_y=-28.706，CeNTer_z=-43.443；size_x=15，size_y=15，size_z=15。為了增加計算的準確度，將參數exhausTiveNess設置為20。其它參數均用默認值。最後，選取打分值最高的構象用PyMoL1.7.6進行結果分析。

2 結果與討論

2.1 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及槲皮素對ABTS自由基的清除效果

以TroLox作為對照，以其濃度-吸光值繪製標準曲線y=0.3627x+0.0661（R2=0.9943），研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4種樣品對ABTs自由基清除效果，結果見圖3。4種樣品對ABTs自由基清除效果以TroLox的抗氧化物質的量表示，結果見表3。

由表3可知，4種樣品對ABTs自由基均有清除作用。以TroLox作為對照，4種樣品的總抗氧化能力結果中，柚皮苷的TroLox抗氧化物質的量為0.1748MMoL/g，NHDC為2.9109MMoL/g，NariNgiNDC為0.6986MMoL/g，槲皮素為39.6103MMoL/g。4種樣品對ABTs自由基清除能力依次為槲皮素＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。

2.2 柚皮苷、NaringinDC、NHDC及槲皮素對羥自由基的清除效果

以TroLox為對照，以其濃度-吸光值繪製標準曲線y=4.0588x+0.079（R2=0.9998），研究柚皮苷、NariNgiNDC、NHDC及槲皮素4種樣品對羥自由基清除效果，結果見圖4。4種樣品對羥自由基清除效果以TroLox的抗氧化物質的量表示，結果見表4。

由表4可看出，4種樣品對羥自由基均有清除作用，試驗中以TroLox作為對照，得到柚皮苷清除能力的TroLox物質的量為19.8μMoL/g，NariNgiNDC為31.9μMoL/g，NHDC為44.4μMoL/g，槲皮素為365.5μMoL/g。4種樣品清除羥自由基能力依次為槲皮素＞NHDC＞NariNgiNDC＞柚皮苷。

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