酶法製備GABA是一個不可逆反應，適宜的酸脱羧酶溫度可以使GABA轉化率達到最大，所以通過設置不同的枯草酶轉化溫度來探究溫度對GABA轉化率的影響。以100g/L的芽孢用穀氨酸為底物，溶於去離子水中，表达加入濕菌體(在55℃水浴鍋預處理50min，谷氨杆菌改善細胞膜的酸脱羧酶通透性)30U/g，在150r/min的枯草水浴搖床中進行轉化，反應過程中，芽孢用控製pH為5.0。表达溫度梯度設置為25、谷氨杆菌30、酸脱羧酶35、枯草40、芽孢用45、表达50℃，反應24h後終止反應並進行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋並過0.22μm有機濾膜後用HPLC-OPA柱前衍生法進行檢測，結果見圖9。轉化率隨溫度升高逐漸提高.當轉化溫度達到40℃時，GAD-0和GAD-PL轉化率達到最高，分別為64.78％和82.27％，繼續升高溫度，轉化率反而降低。這是因為枯草芽孢杆菌細胞壁厚，而反應溫度過低時，底物與胞內酶液無法充分接觸使得轉化率低：當反應溫度過高時，酶與PLP穩定性差，從而影響GABA的轉化率。
以100g/L的穀氨酸為底物.溶於去離子水中，加入預處理過的濕菌體30U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床巾進行轉化，反應過程中，每隔2h用0.6mol/L的H2S04或NaOH調節pH，使其始終與初始pH保持一致。pH梯度設置為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反應24h後終止反應並進行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋並過0.22μm有機濾膜後用HPLC-OPA柱前衍生法進行檢測。結果見圖10，當pH為4.5或5.0時，GABA轉化率最高，GAD-0的GABA轉化率為75.45％和76.21％，GAD-PL的GABA轉化率為84.54％和84.21％。當DH小於4.5時，底物-水穀氨酸鈉在酸性條件下容易酸水解生成穀氨酸析出，從而形成乳白色渾濁液體.不利於酶與底物的充分結合；當pH大於5.0時不利於酶活性巾心的賴氨酸殘基以shifft-堿與PLP、底物結合，從而抑製GABA的生成。可見，酶轉化法製備GABA的pH耐受範圍窄，過酸或過堿都不利於酶促反應進行，考慮在高質量濃度底物下，過低的pH更容易導致底物析出，所以酶轉化最適pH為5.0。
以100g/L的穀氨酸為底物，溶於去離子水中，加入預處理過的不同濕菌體(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴搖床中反應24h，反應過程中，控製pH為5.0。反應結束後進行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋後用氨基酸柱前衍生法進行HPLC檢測。結果見圖11，重組菌全細胞轉化率隨著加菌量的增加而逐漸提高，其中GAD-PL和GAD-0分別在40U/g和50U/g時將底物完全轉化，轉化率達到100％。GAD-PL的加菌量少於GAD-0是因為前者細胞巾的PLP含量高於後者，PLP作為輔助因子有利於酶促反應的進行。
以100g/L的穀氨酸為底物，溶於去離子水中，加入預處理過的不同濕菌體，GAD-0和GAD-PL加入量分別為50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床中反應24h，反應過程中，控製DH為5.0。反應結束後進行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋後用HPLC-OPA柱前衍生法進行檢測，結果見圖12。在0～20h，GAD-0和GAD-PL轉化合成GABA的產量隨時問延長迅速增加，在20h時轉化率達到100％，之後隨著反應進行，轉化率不再發生變化。
以200g/L的穀氨酸為初始底物，溶於去離子水中，加入預處理過的不同濕菌體，GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0為50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴搖床中反應6h後，每隔3h補加1.27g的穀氨酸同體至底物質量濃度分別為200、250、300、350、400g/L，反應過程中，控製pH為5.0，反應48h。反應結束後進行煮沸處理，12000r/min離心5min得上清液，適當稀釋並過0.22μm有機濾膜後用HPLC-OPA柱前衍生法進行檢測。結果見圖13，當底物質量濃度達到400g/L穀氨酸時，GAD-0和GAD-PL轉化生產GABA的轉化率分別從100％(底物質量濃度350g/L穀氨酸)下降為97.72％和98.43％。綜合考慮，為提高工業生產效率和節省下遊分離純化成本，選擇350g/L作為酶法製備GABA的最適底物質量濃度。
作者成功構建並重組表達了含有Escherichiacoli來源的gadB基因的重組菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。實驗表明在發酵過程中添加0.5mmol/L輔酶前體PL的GAD總酶活達到28.14U/mL，是對照總酶活的1.72倍。進一步優化重組菌全細胞酶法生產GABA的工藝條件，結果表明，當溫度為40℃，pH為5.0，GAD-0和GAD-PL的最適加菌量分別為50U/g和40U/g時，GABA轉化率達到100％。當穀氨酸質量濃度為400g/L時，GABA產量分別為275.60紮和273.61g/L。綜上所述，作者考察了菌體發酵培養過程中添加輔酶前體PL對重組菌產GAD及製備GABA的影響，開發了一種不需要在發酵過程和酶轉化體係巾添加昂貴輔酶PLP就能高效生產GABA的T藝技術，為GABA在食品和醫藥行業中的廣泛應用打下了堅實基礎。
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