據報道，反應體係中添加助溶劑可能影響產物的氢酶轉化率和立體選擇性。由於KpADH還原NBP0的合成e.e.值為97％，因此通過溶劑的醇脱催化優化可能提高終產物的立體選擇性和反應轉化率。作者針對單水相體係和水-有機兩相體係進行了研究，氢酶根據不同底物濃度的合成研究結果，固定500mmol/L的醇脱催化底物濃度，保持底物與酶添加量的氢酶質量比(S/C)為18.2:l的條件下，選擇不同的合成醇類助溶劑、有機溶劑以及綠色離子液體BMIN·PF6進行體係的醇脱催化優化。
如表2所示，氢酶反應體係2、合成3、醇脱催化4中分別加入體積分數5％醇類助溶劑，氢酶可以看出助溶劑雖然提高了反應的合成初速率，但是反應很快就在轉化率為60％左右時終止，這是產物抑製導致的。反應5中加入5％的乙酸丁酯，最終轉化率達到98.2％。由於乙酸丁酯的疏水性使得產物空間上與酶分離，因而轉化率得以提升，但也限製了酶與剩餘底物的充分接觸，最終使得反應在24h的轉化率未達到99％以上。少量有機溶劑的添加對e.e.值沒有影響。綜上，其中最佳的反應體係為不加任何助溶劑的磷酸鹽緩衝液體係，在該體係中，反應轉化率可以達到99％以上。
采用水-有機溶劑的兩相體係可實現底物與酶、產物與酶在空間上的相對分離，從而避免酶失活。底物NBPO是疏水性底物，略微溶於水，不利於與酶分子充分接觸。此外，底物對酶分子有一定毒性，這也會導致酶分子的失活，因此嚐試兩相反應體係實現油-水的界麵反應。作者選取了具有不同1gP值的10種有機溶劑進行探究，分別測定了產物和底物在有機溶劑中的分配係數以及有機溶劑對KpADH催化活性的影響，結果見表3-4。最終選擇產物分配係數分別為3.6和15.8以及殘餘活力分別為91％和5％的有機溶劑：甲苯和乙酸丁酯。反應體係6和7表明，50％有機溶劑的加入使e.e.值提高至98.9％。這表明酶在有機溶劑中剛性增強，構象更加穩定。但是，兩相反應體係的轉化率均沒有達到99％的水平，且反應速率較慢，說明大量的底物溶解在有機溶劑中減少了酶與其碰撞的機會,所以反應速率下降，尤其是在反應後期底物較少的情況下，無法與酶充分接觸，導致反應不完全。
從上述反應體係優化的結果可知，未加入任何助溶劑的反應體係1可在24h內催化還原500mmol/LNBP0，達到99.6％的轉化率，見圖4。說明在該反應過程中，底物NBP0逐漸溶解並完全轉化為產物(S)-NBHP，且產物難溶於水相體係，避免了與酶的大量接觸，未對酶活產生顯著影響。加入助溶劑後，反應初速度加快，但增加了產物的溶解度，使之達到抑製濃度(459.9±118.6)mmol/L，所以反應快速終止。另外，與兩相體係相比，大量有機溶劑的加入可以略微提高產物的e.e.值，但轉化不完全會影響終產物的純度。所以，不加任何助溶劑的磷酸鹽緩衝液體係更具備綠色、高效的生物催化製備條件。
因此。在反應體係1的基礎上保持底物與酶添加量的質量比(S/C)為18.2g/g不變，逐漸增加底物的質量濃度至200g/L(1m01/L)，最終反應12h，可實現完全轉化，產物的e.e.值為97％，產品收率為77％。與來源於釀酒酵母的羰基還原酶YDR541C催化合成(S)-NBHP相比，KpADH能夠在不加任何有機溶劑和外源輔酶的條件下實現較高濃度的轉化，表明腳ADH在酶法製備(S)-NBHP上具有良好的應用潛力。
作者篩選和比較發現勳ADH可以高效還原NBPO合成(S)-NBHP。通過反應體係的探索，發現在加入乙醇等助溶劑的反應體係中有較強的抑製效應，且高濃度的產物NBHP對KpADH催化性能影響顯著。通過動力學擬合，發現抑製類型為非競爭性抑製類型，並計算獲得抑製常數Ki值為(459.92±118.59)mm01/L。反應體係優化的結果說明，不添加任何助溶劑的體係能夠有效地避免產物抑製，同時也能使酶與底物充分接觸，反應完全。在此基礎上實現了200g/L底物的完全轉化，克級製備獲得了(S)-NBHP。作者初步探究了NBHP對醇脫氫酶的抑製機製，並優化和建立了解決抑製問題的反應體係，為實現(S)-NBHP的大規模酶法合成奠定了良好的研究基礎。
聲明：本文所用圖片、文字來源《食品與生物技術學報》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
相關鏈接：乙酸丁酯，甲苯，磷酸鹽
