吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone，法测PQQ)是定吡的含一種不同於煙酰胺核苷酸(NAD+和NADP+)和黃素核苷酸(FAD和FMN)的新有機輔酶，上世紀60年代在研究非磷酸化細菌的咯喹咯喹葡萄糖代謝過程中被首次發現。從微生物到人體組織，啉醌啉I量PQQ在自然界的咪唑分布範圍極廣。動物和人類通過飲食途徑獲取PQQ以滿足機體需要。并吡PQQ具有極其獨特的法测理化性質，其促生長、定吡的含抗應激和在動植物發育繁殖方麵的咯喹咯喹營養作用越來越受到重視。目前對於PQQ主成分的啉醌啉I量含量測定方法較多，但測定PQQ中雜質的咪唑方法鮮有報道，本文通過實驗研究建立了HPLC法測定PQQ中咪唑並吡咯喹啉(IPQ)雜質含量的并吡方法。
一、法测材料與方法
1、定吡的含儀器與材料
Agilent1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；METTLER-TOLEDOXS205DU型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；乙腈(上海星可高純試劑有限公司)；磷酸氫二鉀(國藥集團化學試劑有限公司)；四丁基溴化銨(阿拉丁)；磷酸(ScharlabS.L)；PQQ及IPQ對照品為自製；PQQ樣品為自製(批號為17901、咯喹咯喹17902、17903)。
2、色譜條件
TCIKaseisorbLCODS2000色譜柱(4.6mm×150mm，5lxm)；流動相為乙腈-緩衝溶液(配製10mmol的磷酸氫二鉀和15mmol的四丁基溴化銨水溶液，用磷酸調節pH至7.4)[28:72]；紫外檢測器，檢測波長為259nm；流速為1.0mL／min；進樣量為20μL。
3、溶液配製
對照品溶液：精密稱取PQQ對照品適量，用稀釋劑(乙腈-水=[1:3])定量稀釋製成每lmL中約PQQ 0.1μg的溶液。供試品溶液：精密稱取PQQ樣品適量，用稀釋劑定量稀釋製成每lmL中約PQQ 0.1mg的溶液。
4、檢測方法
取對照品溶液與供試品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰麵積按外標法計算供試品中IPQ的含量。
二、結果與討論
1、專屬性試驗
取空白溶液、對照品溶液和混合溶液進樣並記錄色譜圖，並用tPQ對照品溶液進行定位；確定出峰順序與分離度，PQQ於IPQ之間的分離度為3.1，大於1.5，空白溶液無幹擾。空白溶液圖譜見圖1，對照品溶液圖譜見圖2，混合溶液圖譜見圖3。
2、檢測靈敏度試驗
精密稱取IPQ對照品適量，用稀釋劑溶解並逐級定量稀釋，測試IPQ峰的信噪比，確定檢測限和定量限，試驗結果見表1，檢測限圖譜見圖4，定量限圖譜見圖5。擬定PQQ中IPQ的限度為不大於0.1％，本文綜合檢測限與定量限的結果選擇0.05％為報告水平。
3、精密度試驗
0.10％和0.15％水平加入IPQ，每個濃度依法平取同一對照品溶液，連續進樣6次，記錄色譜圖，結果對照品溶液種主峰麵積的RSD為1.4％，表明儀器精密度良好。取同一批樣品，依法平行操作製備6份供試品溶液，分別測定，結果均未檢出IeQ。取同一批樣品，分別在0.05％、0.10％和0.15％水平加入IPQ，每個濃度依法平行操作製備3份加標溶液，分別測定，結果9份加樣回收率的RSD為3.2％，表明方法重複性良好。不同分析員使用不同的儀器對同一批樣品進行測定，結果一致，表明方法中間精密度良好。
4、標準曲線的繪製和線性關係的考察
配製IPQ濃度分別為0.05、0.08、0.1、0.15、0.2μg／mL的溶液，分別進樣並記錄色譜圖，以峰麵積為縱坐標、濃度為橫坐標進行線性回歸，計算線性方程和相關係數，得到線性方程為Y=77.7168X+0.042976，線性相關係數為0.99976，結果表明IPQ在線性範圍內與峰麵積呈良好的線性關係。
5、加樣回收率試驗
分別在供試品中加入規定濃度的0.05％、0.10％和0.15％水平的IPQ，依法處理並測定，計算加樣回收率，結果見表2。結果表明該方法具有較好的準確度。
6、溶液穩定性試驗
配製對照品溶液和供試品溶液，分別室溫放置12h、24h、36h後進樣檢測，放置後與0h檢測結果相比，對照品溶液PQQ峰麵積變化均不大於4.0％，供試品溶液測定結果一致，表明溶液在36h內穩定。
7、耐用性試驗
分別改變測試條件，如改變流動相中有機相的比例、流動相中緩衝溶液的pH、柱溫及流速，依法測定，結果與標準條件下測定結果一致，表明本方法具有良好的耐用性。
8、樣品含量測定
取PQQ樣品，依法測定，結果均未檢出IPQ，表明產品均符合擬定質量指標要求，具體見表3。
在方法建立過程中，考慮到IPQ雜質相對於PQQ產品的製備成本會高很多，對IPQ相對於PQQ的相對響應因子(RRF)進行了測試，結果為1.089，介於0.9～1.1之間，因此采用PQQ作為外標法計算的對照品，大大減少了IPQ雜質對照品的用量。
三、結論
方法學驗證表明，建立的HPLC法測定PQQ中IPQ含量的方法，具有良好的專屬性、檢測靈敏度、精密度、線性和準確度，方法較為簡便，準確可靠，能夠比較好地控製產品質量，易於推廣應用，適用於PQQ中IPQ的質量控製。
聲明：本文所用圖片、文字來源《中國食品添加劑》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
相關鏈接：磷酸氫二鉀，四丁基溴化銨水，乙腈，磷酸
