2、高效HPLC標準曲線的液相繪製
按上述色譜條件，以自製花椒麻味物質為標樣，色谱進行HPLC檢測，定量的建樣品有三個主峰，检测保留時間在22～24min之間，花椒含量如圖4所示。麻味再將標準品(55μg／mL)用甲醇將其配製成一係列梯度的物质花椒麻味物質標準使用液(μg／mL)：0、10、高效20、液相30、色谱40、定量的建45。检测分別精密量取20μg標準使用液進行高效液相色譜檢測。花椒含量以保留時間在22～24min的麻味峰為目的峰，以其HLPC峰麵積之和作為縱坐標，對應標樣的濃度作為橫坐標，繪製標準曲線(圖5)。
算得出該曲線的回歸方程為：y=421097x+73819(R2=0.9994)
3、高效液相色譜(HPLC)檢測法的技術指標研究
（1）HPLC方法的檢出限
本研究用高效液相色譜法檢測花椒麻味物質的檢出限(圖6)。檢出限附近的標準曲線為y=0.2623x+0.0l(R2=0.9716)，其標準差為0.0063；應用公式計算出該方法的檢出限為0.0339μg/mL。
(2)方法的準確度
取4份已知花椒麻味物質含量的樣品，再各分成兩份，一份不加入花椒麻味物質標準品(A樣)，另一份加入標準品(B樣)。花椒麻味物質標準品的加入量分別為1.4、1.6、1.8、2.0μg/mL。應用上述HPLC法測定A、B樣中花椒麻味物質的含量，測定結果如表l所示。當花椒麻味物質標準品加入量為1.4μg/mL時，回收率範圍為87.8％～112.8％；加入量為1.6μg/mL時，回收率範圍為90.0％～107.5％；加入量為1.8μg/mL時，回收率範圍為94.4％～105.0％；加入量為2.0μg/mL時，回收率範圍為98.0％～103.5％。
（3）方法的精密度
在檢測條件：島津LC-10AT型分析型高效液相色譜儀，HC-C18型色譜柱，以1.0mL／min15min50％甲醇和水溶液梯度洗脫，10min70％甲醇和水溶液洗脫，柱溫為35℃，紫外檢測波長254nm。取10組均勻樣品，預處理後分別采用HPLC法測定花椒麻味物質的含量，連續、精確重複測定lO次，測定結果見表2。10組數據的相對標準偏差(變異係數)均小於5％，其變動範圍為0.20％～1.6l％，說明這一方法具有較好的重複性。
三、討論
花椒麻味物質具有多種生理活性及食用價值，但對花椒有效成分的開發和利用方麵仍不足，未充分發揮其優勢。定量測定花椒麻味物質含量方法為花椒質量評價標準和食品工業中花椒原料的選擇可提供一定的理論依據。目前用到的定量測試方法主要有高效液相色譜法、氣質聯用法、氣相色譜法、薄層層析法、近紅外光譜法、紫外分光光度法以及基於甲醛滴定快速測定法。HPLC在物質含量的定量檢測方麵應用較為廣泛，其原理為：通過檢測器的響應信號和檢測器中物質的含量與成正比，利用峰麵積大小來反映溶液中溶質含量。目前，文獻中用HPLC法對花椒麻味物質進行檢測，檢測方法中所采用的洗脫劑種類、色譜柱類型等都各不相同，考慮到實驗條件、實驗目的、色譜柱性能、價格等因素，我們在研究中選用了最常見、分離效果好、價格適中的HC—C18柱。
在預備實驗中，用反相薄層層析法對花椒麻味物質進行分析研究，研究發現采用70％的甲醇和水溶液作展層劑能有較好的分離效果，因此在HPLC分析中，也以適量濃度的甲醇和水溶液作為流動相。研究發現，采用甲醇和水溶液的梯度洗脫時分離效果較好，根據數次實驗後確定的流動相濃度為：初始濃度為溶液濃度為50％，結束時溶液濃度為70％。研究中發現柱溫為35℃時，理論塔板數最高，洗脫峰時間間隔最大，花椒麻味物質含量在0～300μg／mL範圍內，花椒麻味物質含量和響應峰麵積具有較高的線性相關度。
綜上所述，用上述方法，標準品和樣品中的麻味物質出峰位置一致，目標峰無拖尾、無分叉、分離度高，說明高效液相色譜法能將花椒麻味物質從其他物質中較好地分離出來。通過HPIC對其進行檢測該方法的技術指標：檢出限為0.0339μg／mL，回收率87.8％～112.8％，重複性實驗中花椒麻味物質含量的標準偏差的變動範圍為O.20％～1.61％，該方法其準確度和精密度都較好。花椒麻味物質能定量來衡量花椒品質的優劣，為進一步研究花椒有效成分和花椒質量管理奠定了良好的理論基礎，從而推動我國花椒產業化發展。
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