枸杞（wolfberry，褐变黑枸RW）是杞对我國重要的藥食同源類植物資源。枸杞富含枸杞多糖、紫外照射β-胡蘿卜素等多種活性成分，损伤寿命是果蝇珍貴的中藥材和滋補保健食品。現代醫學研究表明枸杞具有保護視神經、及抗抗衰老、氧化保護細胞、褐变黑枸調節免疫力，杞对降血糖和調節血脂等多種藥理功效。紫外照射近年來，损伤寿命枸杞的果蝇抗氧化、抗衰老逐漸成為研究熱點。及抗
美拉德反應是氧化一種非酶褐變，主要是褐变黑枸指羰基化合物（還原糖類）和氨基化合物（氨基酸和蛋白質）間的反應，經過複雜的曆程最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質類黑精。類黑精是美拉德反應產物中主要的抗氧化成分。有研究表明，美拉德反應中間產物（maillardreactionproducts，MRPs）不僅可改善產品色澤、風味，還具有較強的抗氧化性。
近年來，隨著人們對養生保健的重視，枸杞功能性食品的研究和開發越來越深入，特別是枸杞作為抗氧化食品的開發，已成為枸杞加工業研究的熱點。美拉德反應與枸杞結合後的褐變黑枸杞（brownblackwolfberry，BBW）抗氧化作用是否優於紅枸杞單品，也尚未見報道。基於此，本試驗采用美拉德反應原理，首次將枸杞與美拉德反應結合，製備褐變黑枸杞，評價其對紫外損傷果蠅壽命及抗氧化指標的影響，為褐變黑枸杞的抗氧化研究提供理論支持。
一、材料與方法
1、樣品
以寧夏枸杞為原料，在75%相對濕度和700C條件下放置6天，再在450C的鼓風烘箱中幹燥定型。幹燥風速0.5m/s，幹燥時間60min即可。得到的褐變黑枸杞在溫水中浸泡、打漿、離心、取上清液，濃縮備用。
2、實驗動物
野生型Oregon品係黑腹果蠅，由天津科技大學食品添加劑與功能配料研究室提供，置於光暗周期為12h、溫度為250C、濕度為65%～75%的恒溫恒濕培養箱中培養。
3、儀器與試劑
HWS-850智能恒溫恒濕培養箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；MR23i冷凍離心機：美國Thermo公司；UVmini-1240紫外/可見分光光度計：日本島津儀器公司；RE2000A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化器廠；紫外燈（20W）。無水葡萄糖、瓊脂粉：分析純，天津江天化工有限公司；對羥基苯甲酸乙酯：分析純，北京鼎國昌盛生物技術公司，玉米粉、酵母粉：市售；過氧化氫酶（CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（測分型）、考馬斯亮藍試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所。
4、方法
（1）果蠅培養基製備
基礎培養基：玉米粉72g，無水葡萄糖72g，瓊脂6g，酵母粉10g，40mL防腐劑（1%對羥基苯甲酸乙酯的75%乙醇溶液），750mL蒸餾水。
給藥培養基：在基礎培養基基礎上分別按照終濃度3mg/mL、12mg/mL添加相應劑量的褐變黑枸杞和紅枸杞。
（2）壽命實驗
收集2d齡雌、雄性果蠅各1200隻，平均分為6組，每組200隻，其中兩組飼喂基礎培養基，其中一組不照射紫外線，作為正常對照組（NC），另一組每天照射15min，作為模型對照組（MC），其餘四組分別飼喂實驗用培養基即加入3mg/mL、12mg/mL的紅枸杞和褐變黑枸杞，分別命名為RL、RH、BL、BH，每天照射紫外線15min，每3天更換新培養基並記錄死亡數，直至果蠅全部死亡。將自然死亡的果蠅生存天數進行統計學處理，過度麻醉和培養基粘住不計算在內。每組全部果蠅死亡天數的平均數為該組的平均壽命，各組最後20隻死亡果蠅的天數平均數為該組的最高壽命，每組中半數果蠅死亡天數的平均數為半數死亡壽命。
（3）果蠅SOD、CAT、MDA含量的測定
收集2d齡雌、雄性果蠅各1200隻，隨即分為正常對照組、模型對照組、褐變黑枸杞低、高劑量組和紅枸杞低、高劑量組，每組200隻。收集2d齡雌、雄性果蠅各1200隻，平均分為6組，每組200隻，其中兩組飼喂基礎培養基，其中一組不照射紫外線，作為正常對照組（NC），另一組每天照射15min，作為模型對照組（MC），其餘四組分別飼喂實驗用培養基即加入3mg/mL、12mg/mL的紅枸杞和褐變黑枸杞，分別命名為RL、RH、BL、BH，每天照射紫外線15min，每3天更換新培養基並記錄死亡數，直至果蠅全部死亡。將自然死亡的果蠅生存天數進行統計學處理，過度麻醉和培養基粘住不計算在內。每組全部果蠅死亡天數的平均數為該組的平均壽命，各組最後20隻死亡果蠅的天數平均數為該組的最高壽命，每組中半數果蠅死亡天數的平均數為半數死亡壽命。20d後將果蠅饑餓2h後用工業氮麻醉後稱重，記錄果蠅質量，按照1：49（mg/mL）加人已滅菌的生理鹽水在冰浴條件下勻漿，40C、3500r/min離心10min後取上清液得10%果蠅勻漿液。按照試劑盒說明書分別測定果蠅SOD活性（羥胺法）、CAT活性（可見光法）和MDA含量（TBA法）。
5、統計學分析
數據以平均數土標準差（x±s）表示，數據處理分析，組間差異采用SPSS軟件t檢驗，其中P＜0.05表示差異有顯著性，P＜0.01表示差異有極顯著性。
二、結果與分析
1、褐變黑枸杞對紫外損傷果蠅壽命的影響
由衛生部頒布的《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》規定，果蠅的生存實驗可作為延緩衰老作用的檢測方法之一。其評價指標有平均壽命、最高壽命和半數死亡時間。評定標準為一個指標的一個濃度組具有顯著性即可判定該保健品具有延緩衰老的作用。
由表1可知，與正常對照組相比，模型對照組的平均壽命、最高壽命和半數死亡時間均顯著降低（p＜0.01），說明紫外線照射致果蠅氧化損傷模型造模成功。各劑量組與模型組相比，其平均壽命、最高壽命和半數死亡時間都有所提高。其中，與RL組相比，BH組顯著（p＜0.05）延長雌、雄性果蠅平均壽命和半數死亡時間。同時，相比RL組，BH組顯著延長（p＜0.05）雌性果蠅的最高壽命。說明在該實驗條件下，兩種枸杞對紫外損傷果蠅壽命均有延長作用，但是褐變黑枸杞的延壽效果更顯著，且呈現一定的劑量——效應關係。
2、褐變黑枸杞對紫外損傷果蠅體內SOD活力的影響
由圖1可知，模型對照組的SOD活力顯著（p＜0.01）低於正常對照組，說明每天進行15min紫外線照射能夠加速果蠅衰老，說明果蠅紫外損傷模型造模成功。與模型組相比，各劑量組SOD活力均有一定程度的提高，但是紅枸杞組無顯著性差異，BH組呈現顯著性差異（p＜0.05）。與RL組相比，BH組SOD活力顯著提高（p＜0.05），同時，BH組相較於RH組顯著提高（p＜0.05）SOD活力。說明在該實驗條件下，褐變黑枸杞能夠在果蠅受到紫外線輻射後提高果蠅機體內的SOD活力，對紫外線所造成的氧化損傷有一定的拮抗作用。
3、褐變黑枸杞對紫外損傷果蠅體內CAT活力的影響
由圖2可知，與正常對照組相比，模型對照組CAT活力顯著降低（p＜0.01），說明紫外損傷模型造模成功。與模型對照組相比，各劑量組CAT活力均有所提高，其中BH組顯著提高雌、雄果蠅CAT活力。與RL組相比，BH組能顯著抑製（p＜0.05）紫外線損傷下CAT活力的降低。
4、褐變黑枸杞對紫外損傷果蠅體內MDA含量的影響
由圖3可知，與正常對照組相比，模型對照組MDA含量顯著性升高（p＜0.05），說明紫外線照射能夠導致果蠅氧化損傷，說明紫外損傷模型造模成功。與模型組相比，各劑量組均有一定程度的降低，其中，BH組能顯著降低（p＜0.05）雌、雄性果蠅MDA含量，RH組能顯著降低（p＜0.05）雌性果蠅MDA含量。相比較於RL組，BH組能極顯著降低（p＜0.01）雌性果蠅MDA含量。表明在該實驗條件下，褐變黑枸杞對紫外線所造成的氧化損傷有一定的拮抗作用。
三、討論
衰老的自由基學說認為，衰老過程中的退行性變化是由於細胞正常代謝過程中產生的自由基的有害作用造成的。SOD和CAT構成機體主要的抗氧化酶係統，它可清除自由基，減輕和阻斷脂質過氧化作用，保護機體免受自由基的損傷。MDA是自由基對不飽和脂肪酸引發的脂質過氧化作用的最終產物，其含量反映機體脂質過氧化的程度。
本實驗結果表明，紫外線照射能對果蠅造成氧化損傷，能顯著縮短果蠅的壽命，降低SOD和CAT的活力，提高MDA的含量。褐變黑枸杞對紫外損傷果蠅具有一定的保護作用，尤其是高劑量褐變黑枸杞能顯著延長紫外損傷的雌雄果蠅的平均壽命、最高壽命和半數死亡時間，並呈現一定的劑量一效應關係。同時，與紅枸杞相比，高劑量褐變黑枸杞能顯著提高紫外損傷的雌雄果蠅SOD和CAT活力，降低MDA含量。表明褐變黑枸杞對紫外線照射導致的氧化損傷具有一定的保護作用，作用機理可能是通過提高SOD、CAT的活性，增強機體清除多餘自由基的能力，減少自由基引起的生物膜脂質過氧化反應，降低機體MDA的含量，從而起到體內抗氧化的作用。綜上所述，褐變黑枸杞可通過清除氧自由基及抗脂質過氧化而延緩衰老，這為今後開發枸杞保健食品提供了科學的理論基礎。
聲明：本文所用圖片、文字來源《食品添加劑》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
相關鏈接：枸杞，β-胡蘿卜素，羥基苯甲酸乙酯
