食用色素按其來源可分為食用天然色素和食用合成色素兩大類。食用色素食用天然色素是人工從有色的動、植物體內提取，合成經進一步分離精製而成。测定合成色素因其著色力強，食用色素易於調色，人工在食品加工過程中穩定性能好，合成價格低廉，测定在食用色素中占主要地位。食用色素目前，人工國內外使用的合成食用色素絕大多數都是食用合成色素。合成色素主要來源於煤焦油及其副產品，测定且在合成過譬皇?食用色素能受鉛、砷等有害物質汙染，人工因此在使用的合成安全性上，其爭論要比其他類的食品添加型要歲突出和尖銳。中國許可使用的合成色素有9種：莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、新紅、檸檬黃、日落黃、靛藍、亮藍、赤蘚紅。前6種為偶氮類化合物，使用中占絕大多數。食用合成色毒的測定方法主要有薄層色譜法和高效液相色譜法。下麵介紹高效液相色譜法測定食用合成著色劑。
1、原理
食品中人工合成著色劑用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，製成水溶液，注入高效液相色譜儀，經反相色譜分離，根據保留時間定性，與峰麵積比較進行定量。
2、試劑
①鹽酸。
②乙酸。
③正己烷。
④甲醇：經濾膜(O.5μm)過濾。
⑤酰胺粉(尼龍6)：過200目篩。
⑥乙酸銨溶液0.02m01/L。稱取1.54g乙酸銨，加水至1000mL溶解，經0.45μm濾膜過濾。
⑦水取2mL氨水，加水至100mL混勻。
⑧水一乙酸銨溶液0.02mol/L。取氨水0.5mL加乙酸銨溶液(O.02mot／L)至1000mL混勻。
⑨甲醇一甲酸溶液6+4。取甲醇60mL，甲酸40mL混勻。
⑩檸檬酸溶液：取20g檸檬酸(C6H807·H20)加水至100mL，溶解混勻。
⑪無水乙醇-氨水-水溶液7+2+1。取無水乙醇70mL、氨水20mL、水lOmL混勻。
⑫三正辛胺正丁醇溶液 5％。取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL混勻。
⑬飽和硫酸鈉溶液。
⑭硫酸鈉溶液：2g／L。
⑮pH6的水水加檸檬酸溶液調pH6。
⑯合成著色劑標準溶液準確稱取按其純度折算為100％質量的檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、新紅、赤蘚紅、亮藍、靛藍各0.100g，置於lOOmL容量瓶中，加pH6的水到刻度，配成水溶液(1.00mg／mL)。
⑰合成著色劑標準使用液 臨用時將上述溶液加水稀釋20倍，經0.45μm濾膜過濾。配成每毫升相當於50.0μg的合成著色劑。
3、儀器
高效液相色譜儀，帶紫外檢測器，254nm波長。
4、操作方法
(1)樣品處理
①橘子汁、果味水、果子露汽水等：稱取20.O～40.Og放入100mL燒杯中。含二氧化碳樣品加熱驅除二氧化碳。
②配製酒類：稱取20.0～40.0g放入100mL燒杯中，加入小碎瓷片數片，加熱驅除乙醇。
③硬糖、蜜餞類、澱粉軟糖等：稱取5.00～10.OOg，粉碎樣品，放入100mL小燒杯中，加水30mL，溫熱溶解，若樣品溶液pH較高，用檸檬酸溶液調pH至6左右。
④巧克力豆及著色糖衣製品：稱取5.00～10.OOg，放入100mL小燒杯中，用水反複洗滌色素，至巧克力豆無色素為止，合並色素漂洗液為樣品溶液。
(2)色素提取
①聚酰胺吸附法：樣品溶液加檸檬酸溶液調pH為6，加熱至60℃，將1g聚酰胺粉加少許水調成粥狀，倒入樣品溶液中，攪拌片刻，以G3垂熔漏鬥抽濾，用60℃pH 4的水洗滌3～5次，然後用甲醇一甲酸混合溶液洗滌3～5次(含赤蘚紅的樣品用液一液分配法處理)。再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發至近幹，加水溶解，定容至5mL。經濾膜(O.45μm)過濾，取10μL進高效液相色譜儀。
②液-液分配法(適用於含赤蘚紅的樣品)：將製備好的樣品溶液放入分液漏鬥中，加2mL鹽酸、三正辛胺正丁醇溶液(5％)10～20mL，振搖提取，分取有機相，重複提取，直到有機相無色，合並有機相，用飽和硫酸銨溶液洗兩次，每次10mL，分取有機相，放蒸發皿中，水浴加熱濃縮至10mL，轉移至分液漏鬥中，加60mL正己烷混勻，加氨水提取2～3次，每次5mL，合並氨水溶液層(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗兩次，氨水層加乙酸調成中性，水浴加熱蒸發至近幹，加水定容至5mL。經濾膜(0.45μm)過濾，取10μL進高效液相色譜儀。
(3)高效液相色譜參考條件
①色譜柱：YWG-Cl810μm不鏽鋼柱4.6mm(內徑)×250mm。
②流動相：甲醇-O.02m01/L乙酸銨溶液(pH 4)。
③梯度洗脫：甲醇20％～35％，5min；35％～98％，5min；98％繼續6min。
④流速：1mL/min。
⑤紫外檢測器：254nm波長。
(4)測定:取相同體積樣液和合成著色劑標準使用液分別注入高效液相色譜儀，根據保留時間定性，外標峰麵積法定量。
5、結果計算式中：
Xi——樣品中著色劑的含量，g/kg；
Ci——樣液中著色劑的質量，μg；
V2——進樣體積，mL；
V1——樣品稀釋總體積，mL；
m——樣品質量，g。
6、說明
①最小檢出量：新紅5ng，檸檬黃4ng，莧菜紅6ng，胭脂紅26ng。
②允許相對誤差≤10％。
③樣品不含赤蘚紅時，用聚酰胺吸附法；含赤蘚紅時，用液-液分配法
④測定一個樣品後，將甲醇流動相恢複至20％，使之穩定20min後，再開始測定第二個樣品。
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