為了滿足核酸參考品的使用要求，依照方差分析法(F-檢驗法)評價了pDNA的细胞瓶內和瓶間均勻性，並對數據進行了統計學分析。增生质粒质製備的特菌質粒DNA標準物質pDNA Listeria的瓶內均勻性和瓶間均勻性統計數據見表2。結果顯示，考物pDNA的研制性質值在瓶內和瓶間均質性上差異無統計學意義(P>0.05),表明該pDNA滿足qPCR的參考材料的均勻性要求。根據公式計算得出的单核均勻度不確定度為0.67μg/mL。
在4、-20、增生质粒质-70、特菌56℃的考物溫度下進行了180天的短期穩定性評估，並在56℃進行了60天的研制極端溫度測驗，結果表明pDNA Listeria降解不明顯(見表3)。单核采用線性模型作為pDNA的细胞經驗模型進行長期穩定性評價，通過12個月采樣結果建立單項線性回歸方程Y=β1+β0(β1為-0.017 58,增生质粒质β0為29.51),自由度為n-2和P=0.95(95%置信水平)的學生分布t-因子等於1.812,結果提示|β1|
8個不同實驗室共同測定pDNA的屬性值，測量數據遵循正態分布，並且每個單元的測量數據的平均值的精度相等。8個實驗室定值的平均值29.85μg/mL被認為是pDNA Listeria的屬性值。pDNA定值過程帶來的的不確定度uq由統計公式(4)計算得出，定值引入的不確定度為0.22μg/mL。
質粒DNA參考材料的不確定度包括由不均勻性引入的不確定度(uh)、長期保存穩定性引入的不確定度(us)、定值過程中引入的不確定度(uq),綜合三種不確定度按照公式(5)計算參考物質的標準不確定度，按公式(6)計算擴展相對不確定度，結果表明標準不確定度1.57μg/mL。擴展不確定度為3.14μg/mL。
通過梯度稀釋pDNA Listeria作為模板(106、105、104、103、102和101copy/mL)進行qPCR分析。每個反應重複3次，並根據循環閾值(Ct值)與模板濃度之間的關係建立標準曲線(見圖3)。各標準曲線的線性相關係數如表4所示。在本研究中，所有靶基因的擴增效率在94.3%～98.1%的範圍內，且線性良好，表明合成基因片段可作為qPCR標準品，且qPCR核酸檢測參考品可用於單增李斯特菌的檢測。使用低至101copy/mL的模板濃度(每次9次重複反應),可以在7次中檢測到全部3個基因。結果表明，所有qPCR檢測的LOD值(檢測下限)約為101copy/mL(見表4)。
使用了基因組標準品和質粒DNA參考材料梯度稀釋為模板繪製標準曲線，每條標準曲線重複6次。統計分析每個標準曲線的擴增效率和斜率(t檢驗)。結果證明，通過評估斜率和擴增效率，在95%置信度下，基因組DNA建立的標準曲線與pDNA Listeria建立的標準曲線之間差異無統計學意義(P>0.05),見表5。因此，可以使用pDNA Listeria代替基因組DNA來檢測單增李斯特菌。
傳統的基因檢測標準物質通常為病原體基因組核酸提取物，但是由於需要檢測的靶標序列在基因組中不能以均勻和量值可溯源的形式存在，因此在進行質量評價的時候，靶標序列和量值都難以溯源，各個實驗室的檢測結果難以進行比較。因此亟需研製新型核酸參考材料。
人工DNA合成技術為參考標準物質的製備提出了新的可能，可以通過人工合成獲得完整的基因片段，甚至通過基因工程技術將多個目的基因串聯在同一個質粒載體上，進而實現同時對多個檢測目的基因的檢測進行質量參考。
本研究中，根據李斯特菌檢測的需要，構建了pDNA Listeria作為單增李斯特菌定性檢測和檢測性能評價的參考品。一個質粒同時覆蓋hlyA、plcB、inlA 3種檢測目標。檢測序列根據NCBI公布的hlyA、plcB、inlA序列人工合成，質粒的濃度由不同的實驗室聯合定值確認，因此在序列的準確性和量值的可溯源性上，均可提供穩定的保障。同時通過對pDNA Listeria進行均勻度和穩定性分析，顯示pDNA Listeria純度良好，均勻性、穩定性滿足ISO指南35的相關要求。同時通過qPCR分析了pDNA Listeria在單增李斯特菌qPCR檢測中的應用，結果顯示，使用pDNA Listeria製備的標準曲線，線性良好，可替代單增李斯特菌基因組DNA用於hlyA、plcB、inlA 3基因的PCR檢測的質量參考。
因此，本研究研製的單增李斯特菌質粒DNA參考物質為單增李斯特菌hlyA、plcB、inlA基因PCR相關檢測提供了量值溯源的依據，為單增李斯特菌檢測實驗室質量控製提供了有力保障。質粒DNA標準物質具有短期內可大量複製、經濟高效、量值準確可靠等特點，目前在單增李斯特菌檢測中，已見單獨使用hlyA基因製備質粒標準品的報道。在沙門菌檢測中，也有使用包含invA基因質粒作為PCR檢測參考品的報道。但是將多種可用於鑒定和毒力分析的靶標合成到一個質粒中，實現一種參考品對多種檢測靶標進行質量參考的實踐尚未見報道。通過此項研究，希望該標準物質在我國單增李斯特菌檢驗實驗室能夠較好推廣應用，能夠較好地提高單增李斯特菌檢驗實驗室相關項目的檢測水平，保障各實驗室測量結果的可比性、準確性，為檢驗結果的互認和共享打下了良好的基礎，為預防由單增李斯特菌引發的大規模突發性公共安全事件進行技術儲備。
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