真菌色素是真菌天然色素的重要來源，具有獨特的色素生產優勢和生物活性，主要有紅、分离黃、表征藍三大色係。及培相對於紅色色素，养基优化真菌黃色色素的真菌種類較少，但在食品、色素化妝品等方麵具有廣闊的分离市場前景。目前已發現產黃色色素的表征真菌主要有(1)紅曲黴屬(Monascusspp)產生萘醌類紅曲黃色素，並已商業化生產；(2)曲黴屬(Aspergillus)A．cristatus和A．xavus產生羥基蒽醌類黃色素；(3)青黴屬Penicilliumcitreonigrum產生黃色素；(4)散囊菌屬Eurotiumrubrum分泌蒽醌類棕黃色色素。及培而Simplicillium屬真菌產生的养基优化色素則未見報道。
本實驗室從藍藻培養液中分離出一株共生真菌Simpliciiliumlanosoniveum(DT06)。真菌該真菌在沙氏培養基中合成一種新的色素抗生素、胞外多糖和微量的分离色素，而在含碳無機培養基中則大量合成黃色素(DT06色素)，這也是首次發現Simplicillium屬的真菌能夠合成色素。本文對DT06色素進行分離純化、表征，研究其抗氧化性和穩定性，並采用Plackett—Burman和響應麵設計，對其發酵培養基成分進行優化，為該色素的進一步應用奠定基礎。
一、材料與方法
1、材料
（1）菌種與培養基
真菌DT06(Simplicilliumlanosoniveum)由河北工業大學代謝工程實驗室分離，現保藏在中國科學院微生物研究所菌物標本館，保藏編號HMAS242045。PDA培養基(1L)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，pH自然。
改良BG-11培養基(1L)：NaNO30.76g，K2HP040.48g，MgS04·7H20O.075g，CaCl2·2H200.036g，葡萄糖18g，Criticacidstock(CS)10mL，Tracemetalmix(TM)lmL，pH自然。
（2）材料、儀器與設備
2，2-聯氮-二(3-乙基-苯並噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：南京奧多福尼生物科技有限公司；其他分析純化學品均購自天津大學科威公司。
Agilent-1200高效液相色譜儀：美國Agilent公司；CARy300型紫外光譜分析儀：上海精科儀器廠；RE-5205旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。
2、方法
（1）發酵方法
將4℃保藏的真菌DT06接種於PDA斜麵培養基上，25℃培養5d，無菌條件下配製成孢子懸浮液，接種於100／250mLBG-11培養基中，在25℃、130r／min條件下搖床培養36h製成種子液，以l％的接種量把種子液轉接到80／250mL改良BG-11培養基中，在相同條件下搖床培養7d。
（2）色素的分離與純化
將發酵液在8000r／min條件下離心10min，除去菌絲體，收集上清液。500mL上清液中加入300mL鹽酸酸化的乙酸乙酯，充分震蕩，靜置取上層乙酸乙酯萃取液。濾液低壓蒸餾除去乙酸乙酯，得到的色素用甲醇溶解，再用0．22μm濾膜過濾，得到高純度甲醇色素溶液。
（3）色素的色譜分析及含量計算方法
將得到的高純度色素溶液用適量甲醇稀釋，用紫外-可見分光光度計進行全波段掃描(200～800nm)，以確定最大吸收波長。
采用Agilent-1200高效液相色譜儀進行分析，色譜條件：C18(Kromasil)色譜柱(250mm×4．6mm，5μm)；進樣量：20μL；柱溫：25℃，紫外-可見光檢測器。在上述條件下檢測DT06色素的最佳流動相及流速。
在色素的最大吸收波長下，用吸光度值表示色素含量，色素含量表示為最大吸收波長下每毫升澄清發酵液的吸光度值。
（4）色素的抗氧化活性
分別測定真菌DT06色素對DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和羥基自由基的清除能力。DPPH自由基、ABTS自由基和超氧自由基的清除率計算公式為：[1-(A1-A2)／A0]×100；羥基自由基清除率計算公式為：(A1-A0)／(A2-A0)×100，其中A1、A2和A0分別為實驗組、對照組和空白組的吸光值。相同條件下，用等濃度的維生素C做陽性對照。
（5）色素的穩定性
分別取一定量的色素溶液於具塞試管中，研究不同溫度(4、20、40、60、80、100℃)、光照(黑暗、光照、紫外、12000LX)、pH(2、4、6、8、10)對其穩定性的影響，每24h取樣一次，用280nm處的吸光度值表示色素含量。
（6）培養基各組分的優化
在BG-11培養基的基礎上，利用Plackett-Burman(PB)試驗設計，研究葡萄糖(X1)、NaN03(X2)、K2HP04(X3)、MgS04·7H20(X4)、CaCl2‘2H20(X5)、CS(X6)、TM(X7)對真菌DT06生產色素(Y)的影響，在PB實驗設計結果的基礎上，用Box-Behnken設計(BBD)進行響應麵優化。
二、結果與討論
1、色素的色譜分析
酸化的乙酸乙酯萃取液經減壓蒸餾、甲醇複溶得到高純度色素溶液，呈淺黃色(圖1)。DT06色素能溶於水，不同於A．cristatus產的黃色素。色素甲醇溶液的紫外可見掃描光譜如圖2a所示，在285nm處有特征吸收峰，與P．citreonigrum和E．rubrum黃色素分別在330nm和396nm處的特征吸收峰不同，285nm可以作為檢測波長用於高效液相色譜分析和色素含量測定。
根據色素的極性和色譜柱的性質來選擇合適的流動相和流速，最終確定當流動相為乙腈：水(2:8，V/V)、流速為0.8mL／min時色譜柱對色素的分離效果最好，如圖2b所示，在10.52min左右出現單一峰(7.84min為甲醇溶劑峰)，峰形陡峭、對稱性良好，表明色素純度較高。
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