2.3高壓製備方法的高压確定
初始方法為魯南新時代生物技術有限公司在50mm高壓製備液相(漢邦科技，製備型液相色譜係統，制备中试NS4000)上開發，纽莫是康定以二氯甲烷、甲醇和水體係製備紐莫康定B0，研究國內外未見具體報道。高压張宇等采用了氯仿、制备中试甲醇和水體係，纽莫筆者以二氯甲烷進行實驗，康定毒性低於氯仿，研究價格也低於氯仿，高压放大生產具有一定的制备中试優越性。初始方法：將紐莫康定B0粗品(質量分數為81.2%，纽莫HPLC檢測如圖1所示，康定紐莫康定B0的研究色譜純度為88.58%、紐莫康定C0的色譜純度為8.78%)用甲醇、二氯甲烷混合溶液(V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶4)溶解，波長276nm；柱溫20～30℃；流量70mL/min；上樣量1.7g；流動相，V(二氯甲烷(工業))∶V(甲醇)∶V(水)=43∶9∶1；操作壓力5～5.5MPa。收集B0的HPLC色譜純度>95%的製備液。紐莫康定B0的色譜純度值和紐莫康定C0的色譜純度值是經過麵積歸一化法得到的。以線性原則放大到中試150mm製備柱(Cs-prep150工業製備色譜係統，漢邦科技)，流量調整為630mL/min；進樣量15.3g；其他不變。在此基礎上，對該方法進行了進一步優化。
2.3.1流動相比例的優化
根據正相色譜特點，通過調控二氯甲烷，對流動相比例進行優化。在初始方法中，實驗分析了V(二氯甲烷(工業))∶V(甲醇)∶V(水)的5個比例對紐莫康定B0製備分離的影響，實驗結果如表2所示。
由表2可知：隨著二氯甲烷比例的增加，紐莫康定B0峰的保留時間逐漸增加，B0峰分離度逐漸增大，B0峰和相鄰峰的重合越小。其中，41∶9∶1和42∶9∶1的流動相比例相比，後者B0分離度高於前者，且B0峰型較好，保留時間相差不大。保留時間越長，生產成本越大。綜合考慮B0的分離效果和生產成本，故選擇V(二氯甲烷(工業))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1。
2.3.2上樣量的優化
上樣量在色譜製備中影響著目的峰的分離度及製備效率。因此，在流動相比例確定為V(二氯甲烷(工業))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1的基礎上，實驗選取了3種進樣量(7.5，11.4，15.3g)對紐莫康定B0製備的效果進行研究，實驗結果如表3所示。
上樣量越大，分離度越小。對不同上樣量下的B0峰進行分段收集，並對B0的HPLC色譜純度大於95%的料液進行合並、減壓濃縮和凍幹，得到凍幹粉的質量分別為3.01，4.7，4.8g。3種凍幹粉B0質量分數分別為95.73%，95.77%，95.63%，相差不大。計算收率分別為47.31%，48.63%，36.95%，其表達式為
式中：X為上樣液對應粗品質量；Y為粗品B0質量分數。
由表3可知：上樣量11.4g收率高於上樣量7.5，15.3g。收率高，則在中試、大生產中預示著低成本、高效益，以及製藥企業在市場中較高的競爭力。因此，綜合考慮對紐莫康定B0的分離效果和收率，選擇11.4g上樣量。
2.3.3洗脫流速的優化
在高壓製備液相色譜中，洗脫流速影響柱壓、峰型，進而影響到製備效率及效果。故在確定流動相比例V(二氯甲烷(工業))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1及上樣量11.4g的基礎上，考察了5個洗脫流速(480，530，580，630，680mL/min)對紐莫康定B0製備的影響，結果如表4所示。
由表4知：洗脫流速越大，柱壓越高，峰型越窄。對不同洗脫流速下的B0峰進行分段收集，並對B0的HPLC色譜純度大於95%的料液進行合並、減壓濃縮和凍幹。流速越大，得到的洗脫合並液體積逐漸減小，且減小幅度不大。最終得到的凍幹粉質量分別為4.71，4.70，4.72，4.73，4.72g，其各數值相差很小。
隨著流速的增加，柱壓逐漸增加，而實驗所用150mm高壓製備係統工作壓力為0～7MPa。隨著進樣次數的增加，柱壓會逐漸增高，再生柱子會越頻繁，如此會占用一定的工時和消耗再生溶劑，增加生產成本。另外，在5個流速下，凍幹粉的收率和B0質量分數相差不大。綜上考慮，優選480mL/min的流速作為150mm的製備柱流速。
2.4紐莫康定B0的高壓色譜製備
以優化後的高壓製備條件，在150mm製備柱上進行紐莫康定B0的製備。對B0峰分段收集，連續進樣，合並紐莫康定B0的HPLC色譜純度大於95%的製備液。將合並液進行減壓濃縮，凍幹，得到紐莫康定B0凍幹粉。
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