“蝦醬”是传统中國沿海地區及東南亞地區人們常用的調味料之一，是虾酱性以毛蝦等小型蝦類經醃製、搗碎、中酵發酵製成的母菌糊狀食品，其滋味鮮美，分离回味無窮，鉴定及碳具有獨特的源利用特風味。我國的传统蝦醬生產主要集中在沿海地區，如遼寧、虾酱性山東、中酵天津、母菌江蘇、分离廣東、鉴定及碳海南等。源利用特
蝦醬的传统發酵是一個較為複雜的化學變化過程，傳統的蝦醬生產通常采用自然發酵，且發酵過程受到季節、天氣、溫度等諸多不可控因素影響，使蝦醬的生產周期長，品質不穩定，不利於大規模工業化生產。國內外專家、學者對不同地區的蝦醬發酵工藝及品質進行研究。如：吳帥等研究了低值蝦醬發酵中的風味變化；苑寧等闡述了蝦醬生產過程中的品質變化，以及容易引起食品安全問題的不良因素。還有一部分學者對蝦醬中的微生物進行分離，例如：石敏等從侗族傳統蝦醬分離獲得一些具有蛋白酶、脂肪酶以及其它酶類的活性乳酸菌；孫業盈等從蜢子蝦醬中分離鑒定出1株中度嗜鹽菌MKY2；連鑫等從李錦記公司提供的廣東傳統發酵蝦醬中分離鑒定出產香酵母和產蛋白酶黴菌；呂欣然等在錦州傳統蝦醬中分離出蛋白酶嗜鹽菌。大連因處於黃、渤海交界海域這一獨特的地理位置，故造就了大連傳統蝦醬與眾不同的風味和口感，這與其自身特有微生物環境有著密切聯係。過去對傳統蝦醬中酵母菌多樣性及特性的研究甚少，也鮮有對酵母菌碳源同化利用特性的研究。
本研究通過對大連蝦醬中酵母菌的分離純化，采用26SrDNA菌株進行種屬鑒定，對所分離的酵母進行碳源同化特性研究，所得結果對蝦醬發酵優良菌株的篩選以及工藝優化有重要意義。
樣品蝦醬，大連竹島食品公司的生製蝦頭醬。
YEPD培養基：葡萄糖20g/L，蛋白腖10g/L，酵母10g/L，pH6.0，121℃滅菌20min。
碳源同化培養基：硫酸銨5g/L，磷酸二氫鉀1g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，酵母粉0.5g/L，瓊脂粉15g/L，碳源（葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、檸檬酸、殼聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖）20g/L，pH5.8～6.0，121℃滅菌20min。
甘露醇（分析純）、殼聚糖（分析純）、甘油（分析純），天津市光複精細化工研究所；N-乙酰-D氨基葡萄糖，上海晨易生物科技有限公司；D-山梨糖醇，生工生物工程（上海）有限公司；檸檬酸，天津市石英鍾廠霸州市化工分廠；蔗糖（分析純）、乳糖（分析純）、葡萄糖（分析純），天津市福晨化學試劑廠。
DRP-9162電熱恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；超淨工作台，上海博迅實業有限公司；PCR儀，美國伯樂公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；凝膠成像係統，以色列DNR公司。
在無菌條件下，取5g蝦醬於45mL無菌水中搖勻，過濾。取合適的梯度進行稀釋，稀釋後溶液取0.2mL，均勻塗布於PDA培養基平板上，封口後置於30℃培養48h。選取菌落數為30～300的平板，挑取清晰單菌落或不聚成堆菌落重新平板劃線分離，培養一定時間後，挑取單菌落，在PDA平板上劃線純化，直至得到純種單菌落，觀察並記錄菌落形態，置於4℃保存備用。
觀察分離純化後酵母菌的菌落形態特征，從顏色、光滑度、致密性等方麵觀察並記錄。取典型菌落進行鏡檢，於40倍物鏡下觀察菌體形態並采集圖像。
共配製9種碳源同化培養基，9種碳源包括葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、檸檬酸、殼聚糖、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖。
將分離純化後的酵母菌分別接種於9種培養基平板上，30℃培養相同時間，取出後觀察各培養基上每種酵母菌的生長狀況，進行對比，總結每種酵母菌適宜的碳源生長條件，並采集圖像。
取保藏在-20℃的菌株，加入1mL純淨水懸浮，13000r/min離心30s。再加入400μLTES和0.3g左右的玻璃珠，室溫放置5min。冰浴1min，用渦旋振蕩儀（最大功率）振蕩1min，反複5次。再加入200μL飽和酚溶液，200μL氯仿異戊醇，室溫作用5min。冰浴1min，振蕩1min，反複5次。13000r/min4℃離心10min。取上清，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉，2倍體積冰冷無水乙醇，-20℃沉澱20～60min。13000r/min4℃離心10min，棄上清，加入1mL75%乙醇，顛倒反複洗滌沉澱，13000r/min離心2min，棄上清，晾幹。加入適量的TER（1mLTE緩衝液中加入1μL10μg/μL的RNA酶），37℃溫育20min。取1μL進行電泳，與λHindⅢmarker電泳條帶進行比較，采用凝膠成像儀觀察並采集圖像。
PCR采用通用引物26S1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，26S2：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’進行擴增。
PCR反應體係（50μL）：10×PCRBuffer5μL，dNTP4μL，Taq酶0.5μL，模板2μL，超純水36.5μL。PCR反應條件：94℃5min；94℃20s，50℃30s，72℃1min，30個循環；72℃10min；4℃∞。取PCR產物5μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
PCR產物的測序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。將所得序列在NCBＩ數據庫中進行BLAST同源性比對分析，得到序列後用軟件MEGA5.2進行分析，製作成係統發育樹。
以大連傳統蝦醬為原材料，以PDA為培養基，共分離純化出8株酵母菌。該8株酵母經過多次平板劃線分離純化，確定為純菌落，分別編號為Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8。對以上8株酵母菌進行形態學觀察和顯微鏡檢測，菌落形態及鏡檢結果如圖1所示，各自具體菌落形態學描述見表1。由圖1可見，這8株菌株中有2株菌為紅色，從菌落形態上看，表麵光滑，不透明，產生紅色色素。其餘均為白色，表麵光滑濕潤，不透明，多呈白色，菌落的透明度、顏色都有所差異，其中，有2株白色菌株的菌落邊緣呈模糊狀態。通過鏡檢可知，所分離的菌株大小符合酵母菌的大小，可進一步采用分子生物學的方法對其進行鑒定。
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