本試驗通過已經建立的川省测熒光PCR方法，對四川部分地區自然環境中的重点中虫包蟲蟲卵進行檢測，采集包蟲流行地區石渠縣、包虫病流色達縣、行区甘孜縣、土壤爐霍縣、环境天全縣和寶興縣的卵污環境樣本，提取樣本總DNA，染情采用熒光PCR對細粒棘球絛蟲和多房棘球絛蟲ND1基因進行檢測；結果顯示，况监共采集犬糞850份，川省测陽性82份，重点中虫陽性率12. 4%；土壤61份，包虫病流陽性8份，行区陽性率13. 1%；犬毛39份，土壤陽性3份，环境陽性率7. 7%；水樣80份，均未檢出。本次調查顯示，犬糞、土壤以及犬毛均檢出包蟲蟲卵DNA，土壤是一個不可忽視的傳播因素。提示有必要加強對環境中蟲卵的監測並篩選殺滅環境中蟲卵消毒劑，以確保包蟲病流行區域人和家畜的安全。
細粒棘球絛蟲和多房棘球絛蟲引發的棘球蚴病，統稱包蟲病，是一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，主要感染人、牛羊等家畜以及小型齧齒類動物。包蟲病不僅嚴重危害居民健康，而且導致包蟲病患者因病返貧，嚴重製約了當地社會經濟的發展。四川、青海、寧夏、甘肅以及新疆等省是包蟲病高發地區，其中四川省的甘孜州和阿壩州全州、雅安市的天全縣和寶興縣以及涼山州的木裏縣和越西縣均是包蟲病流行區域。
人和動物感染包蟲病主要是經口感染 (比如誤食被包蟲蟲卵汙染的水和食物，手接觸了被蟲卵汙染的土壤或者犬的皮毛) ，蟲卵經口進入胃，在宿主消化液作用下發育成六鉤蚴經腸壁進入血液。中絛期的幼蟲可在患者及動物體內像腫瘤樣生長發育和侵潤遷移，對肝髒等髒器損害嚴重。包蟲的蟲卵已在孕節內提前發育為六鉤蚴，不需要在外界環境中發育，因此隨糞便排出的蟲卵已經完全發育成熟，對人和其他中間宿主均已具有感染力。除此之外，蟲卵對低溫抵抗力極強，能在外界環境中長期存活並保持感染力。細粒棘球絛蟲蟲卵-80℃至少需要7 d方能徹底滅活，而在7℃可存活200 d以上，21℃可存活50天。多房棘球絛蟲蟲卵在實驗室4℃水中可存活16個月。在德國南部，秋冬季節可存活8個月，夏季可存活78 d，在潮濕土壤中也可存活很長時間。
本試驗的目的是對本省包蟲病流行地區自然環境中包蟲蟲卵汙染情況進行初步調查，為進一步完善包蟲病防控措施提供數據及技術支撐。
1 材料與方法
1.1 樣本采集
共采集新鮮犬糞850份，其中：石渠縣103份、爐霍縣97份、甘孜縣90份、天全縣281份、寶興縣279份；土壤樣本61份，取地表土層1 cm內的土壤，每份100 g左右，其中：石渠縣A鄉20份、石渠縣B鄉21份，爐霍縣10份、色達縣10份，所有土壤樣本均采集於犬舍為中心100平米範圍內；犬頸部毛發樣本39份，其中石渠縣A鄉20份、石渠縣B鄉19份；公路旁地表水樣本80份，其中石渠縣A鄉30份、石渠縣B鄉10份、石渠縣C鄉20份以及爐霍縣20份，每份50 m L左右。由於犬糞是環境中蟲卵的唯一來源，所以采集犬糞、犬舍周圍土壤及犬毛過程中，必須做好安全防護，避免感染包蟲蟲卵。
1.2 主要試劑及儀器
Power SYBR Green PCR Master Mix，購自ABI公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；糞便及土壤樣本徹底破碎采用Bertin Precellys 24組織破碎儀；樣本總DNA提取采用E.Z.N.A Stool DNA Kit；最終檢測儀器為杭州博日9600型熒光PCR儀。
1.3 核酸的提取
所有樣本的核酸提取均采用E.Z.N.A Stool DNA Kit試劑盒，按照說明書進行操作。其中，土壤及犬糞樣本需用Bertin Precellys 24組織破碎儀充分破碎後再進行核酸提取；水體樣本需至少13 000 r/min離心5 min後收集沉澱，再進行核酸提取；犬毛需在50 m L試管中，用超純水充分震蕩洗滌後，13 000 r/min離心5 min後收集沉澱，提取核酸。所有樣本最後洗脫的總DNA於-20℃保存備用。
1.4 檢測方法
通過生物信息學對細粒棘球絛蟲G1，G6和G7株及多房棘球絛蟲大量序列進行比對分析，選取線粒體上ND1基因作為檢測基因，產物長度為98 bp，所用引物序列及反應體係均采用先前本實驗室建立的方法[7]。PCR體係為50μL，上下遊引物終濃度分別為0.3μmol/L，模板1-3μL (約為5 ng) 。反應條件為預變性：94℃5 min；變性94℃30s，60℃退火及延伸30 s，共40個循環，按照儀器默認設置添加熔解曲線分析步驟。其中陽性對照細粒棘球絛蟲和多房棘球絛蟲陽性DNA均由本實驗保存。
2 結果
2.1 檢測結果
所有樣本檢測結果如表1所示，犬糞樣本：石渠縣、爐霍縣、甘孜縣、天全縣和寶興縣包蟲陽性率分別為3.9%、38.1%、27.8%、100%、6.1%和8.2%，總陽性率為12.4%；土壤樣本：石渠縣A鄉、石渠縣B鄉、爐霍縣和色達縣陽性率分別為15.0%、14.3%、20.0%和0，總陽性率為13.1%；犬毛樣本：石渠縣A鄉和石渠縣B鄉陽性率分別為10.0%和5.3%，總陽性率為7.7%；所有水體樣本均為陰性。
2.2 PCR產物的特異性
通過熔解曲線分析，所有陽性樣本的熔解峰均與陽性對照吻合，且均為單峰，說明整個PCR反應特異性好，產物均為目的基因產物，無非特異性產物。
3 討論
四川省甘孜州和阿壩州全州、雅安市的寶興縣和天全縣、涼山州的木裏縣和越西縣是包蟲病流行區域，其中甘孜州、阿壩州的部分地區屬於重度流行區。尤其是甘孜州的石渠縣，是全世界包蟲病研究中心，同時也是最嚴重的地區，而寶興縣、天全縣、木裏縣和越西縣均屬於輕度流行區。
犬糞便中的蟲卵是感染人和動物的唯一階段，感染途徑主要是犬糞汙染環境，包括土壤、水源以及犬體表的被毛等，人和動物通過直接接觸犬糞以及上述被犬糞汙染的環境，經口攝入蟲卵導致感染。由於包蟲蟲卵已在體內發育成熟，排出犬體外就已經具有感染性，而且對低溫具有很強抵抗力，所以一旦犬糞汙染周圍環境，很容易造成人和動物感染包蟲。造成犬糞汙染環境主要有以下因素：
(1) 當地居民對包蟲病認識及重視程度低，犬隻不經常拴養，導致犬糞汙染居住地周邊環境
(2) 夏季牧場時期，犬隻需保護家畜免遭狼、狐狸捕食，必須自由活動，無法拴養
(3) 當地居民對犬糞無法進行有效處理：高原地區地廣人稀，居住分散，很難做到犬糞的統一回收、消毒和處理，因此犬糞長時間暴露於外界環境中。
據報道，在波蘭，從當地種植的蔬菜表麵、野生蘑菇及土壤中均檢測出了多房棘球絛蟲蟲卵DNA。犬糞中的蟲卵粘附於犬被毛，也是造成人感染的一個重要途徑。川西北地區的甘孜州和阿壩州大部分地區犬隻數量眾多，以甘孜州石渠縣為例，目前登記在冊的犬隻大約2萬隻左右，家家養犬，人與犬接觸頻繁，尤其是兒童，在與犬接觸玩耍後未能馬上洗手，很容易將犬體表被毛上的蟲卵攝入口中，造成感染。2017年9月本人在石渠縣德榮瑪鄉調查時發現，就有6~12歲兒童感染包蟲的病例。另據報道，在哈薩克斯坦，1988-1995年期間，包蟲發病率在1.4人/10萬，但從1997-2000年增長到了3.5~8.3人/10萬，其中29%的患者是年齡14歲以下的兒童。犬糞也可能汙染地表水源，但在本研究中所有水體樣本均未檢出包蟲蟲卵，原因可能是水源中即使被汙染蟲卵，數量也很少，加之每份樣本量隻有50 m L，很難富集到蟲卵。因此，對地表水源中蟲卵的檢測可能需要設計專門的過濾裝置，前期對大量水體進行過濾，富集蟲卵，才有可能檢出。本試驗中采用的熒光PCR方法，特異性強，靈敏度高，能夠同時檢出細粒和多房棘球絛蟲，尤其適合複雜樣本 (犬糞、土壤) 中目的基因的檢測，而且對ELISA陰性/陽性樣本複核率高，不存在漏檢和假陽性，非常適合後期環境中蟲卵的持續監測。
寄生蟲蟲卵普遍具有堅固的外殼，除對外界不良環境有較強的適應性外，還對常規的消毒劑具有很強的抵抗力，如柔嫩艾美耳球蟲的卵囊在次氯酸鈉溶液中浸泡0.5 h，對其活力及感染性無明顯影響。由於包蟲蟲卵汙染的均為自然環境，如土壤、草地、犬的被毛等，存在大量易與消毒劑發生反應的有機物，導致消毒效果大大降低，無法達到殺滅蟲卵的效果。因此，後期迫切需要篩選合適的消毒劑，用於高原地區環境中蟲卵的殺滅，以確保人和家畜的安全，提高當地公共衛生水平。
綜上所述，本研究在犬糞、土壤及犬毛樣本中均檢出了包蟲蟲卵DNA，說明當地居民部分程度上存在從環境中感染包蟲的風險。我國從2015年開始，投入大筆專項資金，全麵開展包蟲病防控工作，包括犬隻管理與驅蟲、牛羊免疫、草原鼠害治理以及包蟲病宣傳教育等措施，取得了顯著效果。在此基礎上，如能進一步開展環境中包蟲蟲卵的持續監測，將為進一步降低人和動物感染包蟲風險，以及完善包蟲病防控體係提供數據支撐和技術支持。
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