采用已報道的高效液相色譜法測定S7和S21發酵液上清液水解脫脂奶粉後水解產物中遊離氨基酸的濃度,並比對二者差別。降解菌种及如圖6所示,牛奶兩種枯草芽孢杆菌的原蛋验证發酵液上清液可水解脫脂奶粉生成氨基酸比例相似的水解產物,如均可生成較多親水氨基酸,白酶如穀氨酸(E)和酪氨酸(Y),筛选以及較多的重组植物疏水氨基酸,如纈氨酸(V)、化氢亮氨酸(L)和苯丙氨酸(F)。高效过敏过氧功但南於S7發酵液上清液中含有較多的降解菌种及植物過氧化氫酶,可打開二硫鍵使得更多的牛奶水解位點得以暴露,有效增加蛋白酶對酪蛋白膠粒,原蛋验证特別是白酶其中αs1酪蛋白的水解,同時也就形成了對風味更為有利的筛选水解產物,如相比於S21生成了較多親水氨基酸賴氨酸(K),重组植物且生成的疏水氨基酸濃度和比例也呈顯著下降。
水解產物中的苦澀風味主要來自各類疏水氨基酸,如亮氨酸(L)和苯丙氨酸(F),而甲硫氨酸(M)則會帶來類似肉類、蛋類的不良風味,這對於奶粉的製備是不利影響。為驗證其風味,邀請5位品鑒人對微量S7和S21水解5h後的脫脂奶粉水解液進行感官評定實驗,並給予0~5分的打分。如表3所示,相比於未處理的脫脂奶粉,兩種水解液苦味均有增加,但S7的水解液苦味較低更易被接受。由於植物過氧化氫酶的加入,水解產物中的親水氨基酸增多且疏水氨基酸減少,這使得水解後的脫敏奶製品具有更易接受的風味及應用價值。
將枯草芽孢杆菌S7的脫脂奶粉水解產物進行LC-MS/MS活性多肽鑒定,在獲得肽段序列後與已報道的文獻進行比對。如表4所示,水解產物中含有抗高血壓活性多肽5種,以及抗菌活性多肽、礦物質結合活性多肽、血管緊張素轉化酶抑製活性多肽、免疫調製活性多肽和抗癌活性多肽各1種,這些肽在天然蛋白質巾並無活性,在被水解釋放後才具有活性。他們可以以完整的形式被吸收,在腸道局部發揮各種生理作用,也可以在進入循環係統後產生全身作用。進一步證明植物過氧化氫酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶E混合水解的脫敏奶製品具有更好應用價值。
αs1酪蛋白是奶製品的主要過敏原,人體自身消化係統難以水解,從而導致該過敏原可完整的通過消化係統進入血液從而誘發人體過敏反應。αs1酪蛋白難以被水解的主要原因在於各種酪蛋白容易通過疏水作用和分子問二硫鍵相互交聯形成酪蛋白膠粒,使得過敏原αs1酪蛋白被包裹其中,蛋白酶難以接觸其水解位點。化學還原劑可有效破壞各類二硫鍵,但難以應用於食品工業中。相比而言,生物還原劑則具有用量少、可高溫滅活去除等優點,如烷基過氧化氫還原酶、硫氧還原蛋白還原酶和二氫硫辛酸脫氫酶等均被報道可有效破壞二硫鍵,但這些二硫還原酶均為胞內酶難以適應胞外複雜環境:Sri等報道了來自Bacillussp.MTS的一種分泌型二硫還原酶,但其原始菌非食品安全菌。此外,使用其他來源的分泌型二硫還原酶極可能與篩選獲得的枯草芽孢杆菌蛋白酶E不適配,導致其被蛋白酶水解而無法發揮作用,故挑選枯草芽孢杆菌植物過氧化氫酶輔助水解。存此前的報道中,此酶已被多次證實可幫助細胞和分泌酶對抗氧化應激,本實驗結果表明在其存在的情況下,枯草芽孢杆菌蛋白酶E對於水解αs1酪蛋白的酶活可增強約1.5倍,從而推測該酶可促進蛋白酶水解富含二硫鍵的底物。將獲得的枯草芽孢杆菌蛋白酶E和枯草芽孢杆菌植物過氧化氫酶混合,應用於脫敏奶製品製備,其產品除了具有低過敏原,還有相對容易接受的口感並含有一定的生物功能性多肽,具有較好的食品工業應用價值。
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