目的单核研製一種能夠用於快速鑒定單核細胞增生李斯特菌(以下簡稱單增李斯特菌)的質粒DNA標準物質。方法設計一種質粒DNA包含目前常用於單增李斯特菌檢測的细胞hlyA、plcB、增生质粒质inlA基因，特菌並對其穩定性、考物均勻性和量值可追溯性進行評價。研制評估其在實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測中的单核適用性。結果質粒DNA參考物質的细胞最終定值結果為29.85μg/mL。該質粒DNA參考物質量值可靠，增生质粒质均勻性和穩定性良好，特菌可以在-20℃下保存1年以上。考物質粒DNA參考品在實時熒光PCR檢測中的研制適用性證明，可以保證實時定量PCR檢測結果與單增李斯特菌基因組DNA參考品具有可比性。单核結論研製的细胞質粒DNA標準物質可以替代單增李斯特菌基因組DNA對單增李斯特菌進行質量監控，滿足單增李斯特菌檢測在實驗室質量的增生质粒质有效控製和試驗方法驗證的需要。
單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,以下簡稱單增李斯特菌),歸屬於李斯特菌屬(Listeria),在世界範圍內被公認是一種重要的人獸共患食源性致病菌，該菌具有較強的致病性，可導致單核細胞增多、敗血症、腦膜炎、孕婦流產及死胎等。單增李斯特菌易通過肉乳製品引起人的感染發病，因此世界多國衛生部門已經逐步重視起對單增李斯特菌的防控。
目前單增李斯特菌的實驗室檢測已經從微生物學檢測轉向核酸檢測。PCR方法原理是利用單增李斯特菌區別於李斯特菌屬內其他細菌的多個靶基因選擇特異性序列建立PCR以及實時熒光PCR。單增李斯特菌毒力基因主要集中在兩個毒力島IPI-1和LIP-2,其中李氏溶血素基因(hlyA)、磷脂酶C基因(plcB)屬於LIP-l,內化素基因(inlA)屬於LIP-2。hlyA基因編碼的李斯特菌溶血素O(1isteriolysin,LLO)是單增李斯特菌最重要的一種毒力因子，是單增李斯特菌檢測的關鍵性靶標，聯合檢測三種毒力基因將有助於了解李斯特菌的毒力狀況，並進行相關分型。
但是作為PCR檢測方法相應的核酸參考品目前十分缺乏。基因組DNA作為參考品，難以同時為多個靶標提供可溯源的定量參考。小片段核酸則無法在多種檢測試劑和方法之間提供可參比的參考性。因此新型的可對多種檢測靶標量值溯源的核酸參考材料對於李斯特菌的核酸檢測發展至關重要。
本研究中，擬通過合成含有單增李斯特菌檢測的hlyA、plcB、inlA基因的質粒作為熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)參考品，並就其均勻性、穩定性等性能進行評價，探討其替代傳統基因組參考品的可行性，以期這種可追溯的、有效的參考材料可以解決病原核酸檢測能力快速發展與缺乏參考材料之間的矛盾。
單增李斯特菌標準菌株(ATCC 19115),由廣州海關檢驗檢疫中心保存。全基因人工合成等服務由上海吉瑪生物工程有限公司提供；引物合成、DNA測序由華大基因科技股份有限公司提供。ABI SYBR FAST qPCR Master Mix(2×)(英國New England Biolabs)。
根據單增李斯特菌檢測的hlyA(GenBank:KC770796.1)、plcB(GenBank:JF712529.1)、inlA(GenBank:EF445938.1)基因序列人工合成一段基因作為檢測靶標片段。單個基因的核酸序列可在美國國立生物技術信息中心。將三個基因以1∶1的比例串聯在一起(以不相關的基因片段aagtcg隔開),並克隆到pUC57中以形成重組質粒，命名為pDNA Listeria,擴增純化後用於進一步試驗。
采用紫外分光光度(UV)法對質粒DNA的純度進行鑒定，通過檢測樣品在260、280、230 nm波段的紫外光下的吸光度值(A260,A280,A230),確定樣品純度，排除RNA和蛋白質汙染。質粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之間，A260/A230大於2.0被認為純度符合參考品要求。
依照國際標準化組織(International Organization for Standardization,ISO)規定的方法進行取樣，最小采樣量為1μL,使用UV法分析pDNA的瓶間性和瓶內均勻性。
瓶內均勻性檢測：隨機選擇9管pDNA,從每管樣品的上層、中層和下層分別提取1μL測試用樣品，UV法檢測後方差分析(F-測試)瓶內均勻性。
瓶間均勻性檢測：隨機選擇10管pDNA,並用UV法對每管中提取的1μL樣品重複測量3次，方差分析瓶間均勻性。並根據ISO指南35評估pDNA均勻性的不確定性貢獻。根據公式(1)計算質粒DNA的瓶間不均勻性引起的不確定度(uh):所有公式中變量均改為斜體
其中：Q1為組間差方和，Q2為組內差方和，v1為組間自由度，v2為組內自由度，n為組內測量次數。
在標準物質製備中需要考慮物質的長期穩定性和短期穩定性。分別選擇4、-20、-70℃UV法進行短期穩定性(6個月)試驗，56℃(2個月)進行極端溫度試驗，溫度-20℃作為製備的質粒標準物質的特定儲存條件進行長期穩定性試驗(每月UV法檢測一次，一共檢測12個月)。監測質粒pDNA Listeria在儲存期間的穩定性。並根據ISO指南35評估長時間保存的穩定性，並評估穩定性的不確定性貢獻。進一步根據公式(2)計算質粒DNA在12個月內的長期穩定性引起的不確定度(us):
其中：β1是穩定性線性模型中的斜率，S(β1)是斜率的標準偏差，N是穩定性評估的總時間，N=12個月。
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