乳酸菌是保加指發酵乳糖主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的利亚總稱。其廣泛分布於自然界中，乳杆乳中一般主要存在於人體、菌的及動物體及各種發酵食品中。筛选1905年，发酵Grigoroff首次從酸奶中分離出保加利亞乳杆菌（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）。味物該菌株是保加酸奶發酵劑中重要的菌種之一，具有清腸、利亚整腸、乳杆乳中提高機體免疫力、菌的及抗癌及抗腫瘤等重要的筛选生物學功能。

Kataoka等研發出一種樣品前處理技術-固相微萃取（Solid-phasemicroextraction，发酵SPME）。味物SPME技術具有操作簡單、保加成本低、靈敏度高等優點，廣泛應用在風味檢測的各個領域。武士美等采用SPME-GC/MS技術對保加利亞乳杆菌發酵乳中的揮發性風味物質進行分析，鑒定了乙酸、乙醛、雙乙酰、乙偶姻、乙酸乙烯酯等多種風味化合物，並篩選出具有優良風味的菌株。Bao等采用該技術分析幹酪乳杆菌（Lactobacillscasei）發酵乳中的揮發性化合物，檢測出的主要風味化合物有乙酸、丁酸、雙乙酰和己酸乙酯等。任為一等采用該技術分析發酵乳中的風味物質，發現雙乙酰、乙偶姻、乙醛、2-壬酮等化合物對發酵乳風味貢獻較大。

酸奶是一種受消費者喜愛的傳統發酵乳製品，然而，關於保加利亞乳杆菌在牛乳發酵過程中產生的風味及其發酵特性的報道較少。本研究以來自蒙古國和西藏傳統發酵乳製品中的7株保加利亞乳杆菌為研究對象，係統考察貯藏12h時發酵乳中風味物質的多樣性，並測定發酵和貯藏12h時的pH值、滴定酸度（ＴA）、活菌數和黏度，旨在為傳統酸奶發酵劑的基礎研究提供參考。

1材料與方法

1.1菌株與試劑

內標（InternalStandard，ISＴD）1，2-二氯苯，Sigma公司；全脂奶粉，美國Fonterra公司；MRS液體培養基（MRSBROＴH），英國Oxoid公司。試驗菌株：7株保加利亞乳杆菌由實驗室提供。菌株詳細信息見表1。

1.2試驗方法

1.2.1樣品製備

將真空冷凍幹燥保藏的保加利亞乳杆菌接種於MRS液體培養基中，連續傳3代，使菌株活力達最大。在50mL和200mLMRS液體培養基中擴大培養，離心收集菌體，將菌體重懸於無菌PBS保護劑中製備菌懸液。取適量蒸餾水加熱至50℃，加入11.5%全脂乳粉攪拌溶解，當水溫升至60℃時加入6.5%蔗糖，水合30min，且溫度始終保持在60℃，連續均質2次（65℃，15MPa和35MPa），得到的均質乳在95℃處理5min後快速冷卻至42℃。將製備好的菌懸液以5×10⁷CFU/mL的量接種到均質化的全脂乳中，分裝至樣品瓶，並在42℃發酵。待樣品的pH值達到發酵終點4.5，ＴA在70～90°Ｔ時，將樣品移至4℃貯藏12h，待測。

1.2.2發酵乳的理化特性

1.2.2.1pH值和滴定酸度的測定

發酵乳樣品用雷磁PHS-3C型pH計測量，調整溫度在20～22℃範圍，平行測量發酵乳的pH值。使用電子天平精確稱量5g發酵乳樣品，置於100mL錐形瓶中，向錐形瓶中加入40mL蒸餾水和3滴酚酞指示劑，充分搖動。加入0.1mol/LNaOH標準溶液滴定至出現微紅色且30s內不退色。記錄加入的NaOH標準溶液體積。每個發酵乳樣品測定3個平行。計算滴定酸度（ＴA）的公式（1）如下：

式中：X—發酵乳樣品的酸度，°Ｔ；c—NaOH標準溶液濃度，mol/L；v—滴定時消耗的NaOH標準溶液體積，mL；m—發酵乳樣品的質量，g；0.1—酸度理論定義NaOH溶液的濃度，mol/L。

1.2.2.2黏度的測定

取40g發酵乳樣品，用黏度儀的4#轉子測定其黏度，轉子轉速100r/min，扭矩20%～100%，測定時間30s，每個樣品測定3個平行，取平均值。

1.2.2.3乳酸菌活菌

計數采用稀釋平皿傾注法檢測保加利亞乳杆菌發酵乳中活菌數的變化。用0.85%無菌NaCl對樣品進行10倍梯度稀釋，分別取10^-5，10^-6，10^-7的稀釋液各1mL於無菌培養皿上，37℃厭氧培養48h。

1.2.3揮發性風味物質的測定

使用Agilent7890B氣相色譜儀和5977A質譜儀測定發酵乳中的揮發性風味化合物。將萃取頭（50/30μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基矽氧烷）在Agilent7890B氣相色譜儀進樣口（250℃）老化5min，插入氣相瓶上方，萃取樣品中的風味化合物。萃取條件：溫度50℃，磁力攪拌器轉速300r/min，萃取時間60min。柱溫：采用程序升溫，初始溫度35℃，保持5min；以5℃/min升至140℃，保持2min後以10℃/min速率升至250℃。試驗用載氣為高純氦氣，載氣流速1.0mL/min，不分流進樣。汽化室溫度250℃。電離方式EI離子源，電子能量70eＶ，離子源溫度230℃，質量掃描範圍m/z35～500，發射電流100μA，檢測電壓1.4kＶ，無溶劑延遲。

1.2.4定性與定量分析

利用隨機攜帶Masshunter工作站NISＴ11標準庫自動檢索各組分質譜結果，根據保留時間計算揮發性風味化合物的保留指數（retentionindex，RI）。參考相關文獻報道的RI值鑒定發酵乳樣品中的揮發性風味物質。保留指數（RI）值代入公式（2）計算：

式中：RＴ——保留時間（min）；RＴ_（Z）、RＴ_（Z+1）和RＴ_（X）分別為正構烷烴碳原子數為Z、Z+1和待測物X的保留時間，且正構烷烴碳原子數的保留時間遵循RＴ_（Z）（X）（Z+1）的順序原則。

將1，2-二氯苯溶液作為ISＴD加入發酵樣品中，采用峰麵積歸一化法計算所有組分的相對峰麵積比。樣品中各組分風味物質的濃度代入公式（3）計算：

式中c_i—試驗樣品中各揮發性風味化合物的質量濃度，μg/L；cs—1，2-二氯苯的質量濃度，μg/L；A_i—樣品中待測物質對應的色譜峰麵積；As—ISＴD的色譜峰麵積。
 

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