人乳的高效过敏过氧功蛋白質質量濃度與動物源乳製品有較大差異(見表1)，這使得免疫係統容易將非人源的降解菌种及蛋白質判定為過敏原因子，並引起一係列超敏反應。牛奶酪蛋白作為牛乳蛋白質的原蛋验证主要成分大約占總蛋白質質量分數的80％，其中許多組分並不存在於母乳之中，白酶如αs1酪蛋白、筛选αs2酪蛋白和γ酪蛋白，重组植物這些組分很難被人體內蛋白酶消化水解，化氢並可能以完整的高效过敏过氧功結構進入人體血液中引起過敏反應。目前普遍認為αs1酪蛋白是降解菌种及主要的過敏原，從表1也可以看出，牛奶αs1酪蛋白是原蛋验证人乳和牛乳中差別最大的蛋白質。
αs1酪蛋白作為過敏原極難被降解的白酶原因在於乳製品中酪蛋白相互之問極易形成酪蛋白膠粒，一般南αs1酪蛋白、筛选αs2酪蛋白、重组植物β酪蛋白和κ酪蛋白組成，這些多為分散的、大的、近似球形的膠體粒子，直徑一般在50～600nm之間。有研究表明，酪蛋白膠粒中β酪蛋白和κ(酪蛋白可形成大量分子問二硫鍵，而巴氏滅菌的高溫可使得這些二硫鍵更為複雜，這使得膠粒更難被蛋白酶降解。
一般破壞二硫鍵需要合適的堿性環境和二硫還原酶或與二硫還原酶功能相似的化學還原劑。二硫還原酶包括烷基過氧化氫還原酶、硫氧還原蛋白還原酶川和二氫硫辛酸脫氫酶等；化學還原劑包括口β-巰基乙醇、巰乙酸和二硫蘇糖醇等。此外在生物水解中，許多角蛋白分解菌可生成亞硫酸鹽破壞角蛋白酶中的二硫鍵，從而輔助水解過程的進行。
過氧化氫酶主要存在於細胞及組織內的過氧化體中，參與許多重要反應，是生物體維持穩態的關鍵酶，也被廣泛應用於食品工業，如維持還原環境防止食物被氧化。枯草芽孢杆菌中的植物過氧化氫酶是為數不多的胞外分泌型過氧化氫還原酶，可以催化過氧化氫分解成氧和水。David等的研究表明，其主要功能為協助細胞及細胞分泌的胞外酶對抗環境中的氧化應激。本研究中結合ELISA和質譜鑒定，比對兩株種屬相同的野生菌發酵液酶活，以及胞外酶的差異，發現了枯草芽孢杆菌植物過氧化氫酶除已報道功能外，還具有破壞酪蛋白膠粒的二硫鍵，協助蛋白酶高效水解過敏原αs1酪蛋白。此外，我們還將過氧化氫酶與蛋白酶混合水解脫脂奶粉，使用HPLC和LC-MS/MS分析了水解產物的口感和所生成的功能性多肽，為未來使用混合酶製劑製備脫敏奶製品提供一定理論指導。
E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受態細胞：生工生物工程(上海)股份有限公司產品；枯草芽孢杆菌S7(菌種保藏編號CCTCCN0.M2016532)：中國典型培養物保藏中心；原核表達載體pET-24a(+)：Novagen公司產品。
細菌小量質粒提取試劑盒、細菌基因組提取試劑盒、卡那黴素和TaqDNA聚合酶：生工生物工程(上海)股份有限公司產品；PrimerSTARDNA聚合酶、SYBRPremixExTaqKit和DNA連接酶：大連寶生物工程有限公司產品；Humancaseinalphas1(CSNlSl)ELISA試劑盒：武漢華美生物工程有限公司產品；NuPAGEBis-Tris蛋白質預製膠和脫脂奶粉：賽默飛世爾科技(中國)有限公司產品；其餘試劑均為分析純。
高通量全自動菌種篩選及蛋白質結晶工作站(移液工作站)：瑞士帝肯公司產品：MALDI-TOF/T0F基質輔助激光解析電離串聯飛行時問質譜儀：美國布魯克·道爾頓公司產品；遊離氨基酸分析專用高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司產品；QExactivePlus混合四極軌道質譜儀：美國賽默飛世爾科技有限公司產品。
將從奶牛牧場收集到的土樣處理後，初步獲得3000株野生菌，使用高通量全自動菌種篩選工作站將野生菌轉移至篩選平板(200g/L馬鈴薯煮爛後經6層紗布過濾獲得的濾過液，20g/L葡萄糖，15g/L脫脂奶粉，15g/L瓊脂粉)，挑選產生水解圈的野生菌劃線轉移至新的平板(見圖1)。
將各野生菌編號並轉移至PDA液體培養基(200g/L馬鈴薯煮爛後經6層紗布過濾獲得的濾過液，20g/L葡萄糖)中，30℃恒溫培養至指數生長期，取發酵液上清液測定酶活進行複篩鑒定。先通過0PA法測定針對脫脂奶粉的酶活，再逐步稀釋各個野生菌發酵液上清液，使其針對脫脂奶粉的酶活達到同一水平，以減少發酵液複雜成分帶來的影響，此後繼續以脫脂奶粉作為底物重複相同的水解過程，但使用針對αs1酪蛋白的ELISA試劑盒檢測各個發酵液上清液對於特定過敏原的酶活，以確定各個野生菌對於過敏原的選擇性高低。
將各個野生菌發酵液上清液進行SDS-PAGE分析，對不同相對分子質量大小的膠條進行預處理後，與胰蛋白酶混合，37℃酶解過夜，處理後點靶進行質譜分析，質譜結果與mascot數據庫進行肽段比對鑒定。
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