糖尿病為一種以高血糖為特征的羧甲代謝性疾病，近年來發病率持續上升。基川糖苷酶抑製劑被稱為治療糖尿病的木瓜第四類藥物，可以延緩單糖吸收，多糖的制对α降低餐後高血糖，备及使胰島素的羧甲分泌得到改善。目前葡萄糖苷酶抑製劑的基川來源主要有3種途徑：化學合成、植物提取、木瓜微生物發酵。多糖的制对α植物來源的备及葡萄糖苷酶抑製劑，具有治療作用溫和持久、羧甲副作用小、基川可長期使用等特點。木瓜

目前從植物中提取得到的多糖的制对α葡萄糖苷酶抑製劑主要有：黃酮、生物堿、备及萜類、酚類、多糖等。研究發現，多種植物多糖有抑製α-葡萄糖苷酶的作用，但部分天然多糖的活性與已用於臨床的糖苷酶抑製劑有一定的差距。化學修飾是改善活性的有效途徑之一，通過對多糖殘基上的羥基、羧基、氨基等基團進行修飾，可能會增強活性或產生新的活性。
川木瓜為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠的成熟果實。廣西百色市淩雲縣有豐富的川木瓜資源，其花可作有較好的觀賞價值，果實即可食用又可藥用，有“百益之果”的美稱。川木瓜作食用，含有氨基酸、礦物質、維生素等；作藥用，有軟化血管、降糖、降壓、提高人體免疫力和護肝降酶等功效。

目前國內外對川木瓜的活性的研究主要集中在有機酸、三萜和黃酮類物質上，對川木瓜多糖的研究相對較少。課題組研究發現，川木瓜多糖具有抑製α-葡萄糖苷酶的作用，川木瓜多糖進行羧甲基化修飾可以增強對α-葡萄糖苷酶的抑製作用。不同條件下羧基甲化的產物對α-葡萄糖苷酶的抑製作用有較大的差異。本試驗先優化羧甲基化反應的工藝條件，再測試不同取代度的羧甲基多糖抑酶活性，旨在得到具有較好抑酶活性的羧甲基化川木瓜多糖。

一、材料與方法

1、材料、試劑與儀器

材料：川木瓜購於廣西百色市淩雲縣，切片、晾幹、粉碎過篩備用。

試劑：木瓜蛋白酶；4-硝基酚-2-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）；α-葡萄糖苷酶；阿卡波糖；乙醇、氯乙酸、異丙醇、氫氧化鈉等其餘試劑均為分析純。

分析純。儀器：E-201-C型pH複合電極；CPA64型電子天平；UV-1750紫外可見分光光度計；640一IR傅利葉變換紅外光譜儀；SMARllAB3Kwx-衍射儀；RE-52AA型旋轉蒸發儀；HitachiSU8220掃描電鏡；m-lA-50真空冷凍幹燥機；HHS-21-4電熱式恒溫水浴鍋。

2、方法

（1）川木瓜多糖的提取及純化工藝流程

川木瓜粉末→石油醚回流脫脂→85％乙醇回流除去色素、低聚糖等小分子→抽濾→烘幹濾渣→加入蒸餾水浸提2次→減壓濃縮多糖提取液→乙醇沉澱→離心分離得粗多糖→木瓜蛋白酶脫蛋白→Sevag法脫蛋白→活性炭脫色素→多糖液濃縮→乙醇沉澱→離心分離→冷凍幹燥→得精製多糖。

（2）羧甲基川木瓜多糖的製備

①單因素試驗

采用氫氧化鈉-氯乙酸法製備羧甲基川木瓜多糖。稱取0.50g精製川木瓜多糖於三口瓶中，加入50mL異丙醇，在常溫下攪拌20min，緩慢加入一定濃度的NaOH溶液10mL，繼續攪拌40min，將一定質量氯乙酸加入反應體係中，升溫至一定溫度水浴反應一段時間，反應完成後，冷卻至室溫，用稀鹽酸調pH至中性，裝人透析袋中，用蒸餾水透析48h，減壓濃縮多糖溶液，用3倍90％乙醇沉澱多糖，離心分離，冷凍幹燥，得羧甲基川木瓜多糖，取少量樣品測取代度。以NaOH用量、氯乙酸用量、反應溫度、反應時間為單因素，研究各因素對取代度的影響。

②正交試驗

根據單因素試驗結果，選取NaOH用量、氯乙酸用量、反應溫度、反應時間為考察因素，以羧甲基川木瓜多糖的取代度為製備指標，進行L9（34）正交試驗，優化羧甲基川木瓜多糖的製備工藝，正交試驗因素水平設置見表1。

（3）取代度測定

羧甲基川木瓜多糖的取代度參照文獻進行測定。精確稱取0.05g羧甲基川木多糖，溶於標準鹽酸溶液中，置磁力攪拌器中攪拌溶解，用標準氫氧化鈉溶液滴定，分別記下pH為2.1和4.3時消耗的NaOH溶液體積V₁、V₂，取代度按下式計算。

式中：DS為取代度；

m為羧甲基川木多糖的質量；

c為標準氫氧化鈉溶液的濃度。

（4）紅外光譜分析

取少量幹燥的川木瓜多糖、羧甲基川木瓜多糖樣品與溴化鉀粉末混合研磨後壓片，用紅外光譜儀在4000～400cm^-1範圍內掃描。

（5）掃描電鏡形貌分析

取少量幹燥的川木瓜多糖與羧甲基川木瓜多糖樣品放樣品台上，置離子濺射儀中鍍導電金膜，在5kV高壓下分別觀察不同放大倍數下的表麵結構。

（6）X衍射分析

取少量幹燥的川木瓜多糖、羧甲基川木瓜多糖樣品在X-射線衍射儀上測量X-射線的強度，掃描角度為5～90，掃描速度為7⁰／min。

（7）不同取代度羧甲基川木瓜多糖對α-葡萄糖苷酶的抑製作用

分別選取低、中、高3種取代度的羧甲基川木瓜多糖測定抑製α-葡萄糖營酶的活性，以PNPG為底物，用比色法測試抑製作用。在具塞比色管中試管中加入2mLpH為6.8磷酸鹽緩衝溶液，0.2mL0.1U／mL的。α-葡萄糖苷酶，羧甲基川木瓜多糖溶液lmL，混勻後置37℃水浴15min，再加入20mmol／LPNPG0.3mL啟動反應，在37℃繼續反應20min，加入2mL0.1mol／LNa₂C0₃終止反應，測定400nm處吸光度值。每個樣品重複3次，取平均值，按下式計算抑製除率。

抑製率％=[Ao-（A₁—A₂）]／Ao×100

式中：Ao為磷酸緩衝液代替多糖溶液的吸光度；

A₁為加入多糖溶液後的吸光度；

A₂為磷酸緩衝液代替PNPG的吸光度。

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