丹參是丹参大孔唇形科植物丹參(SalviamiltorhizaBge)的幹燥根和根莖。味苦；性微寒。树脂功能主治：通經止痛，优化活血化瘀，工艺涼血消癰，及其究清心除煩。抗疲用於症瘕積聚，劳活胸痹心痛，性研心煩不眠，丹参大孔熱痹疼痛，树脂痛經經閉，优化月經不調，工艺瘡瘍腫痛。及其究丹參的抗疲活性成分有脂溶性成分丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅱ-A、劳活隱丹參酮和水溶性成分丹參素、原兒茶醛等。其中丹參酮(tanshinone)類作為丹參的主要有效成分，有較強的生理活性以及廣泛的藥理作用，包括心血管藥理作用、天然抗氧化、性激素作用、抗腫瘤作用等。疲勞又稱疲乏，是一種主觀不適感覺，但客觀上會在同等條件下失去其完成原來所從事的正常工作和活動的能力。現在社會加快的生活節奏和增大的社會競爭及家庭壓力，使疲勞人群不斷增多，且程度更加嚴重，發生後如果不及時緩解，就會逐漸積累，最終導致機體的神經、內分泌及免疫等係統調節失常，嚴重的會導致器質性病變，嚴重影響人身心健康。因此對於抗疲勞藥物的研究意義重大。一些文獻和專利報道了關於丹參酮的提取分離，但提取方法複雜且成本高，限製了對丹參酮的深入研究。本實驗利用大孔樹脂對丹參提取物進行分離優化，此方法環保衛生、節約成本。大孔吸附樹脂色譜的原理是吸附和分子篩原理相結合。近年來該技術已廣泛應用於中藥新藥研發和中藥製劑研發生產中，基本已成為分離中藥化學成分的主要手段之一，具有選擇性好，吸附速度快，分離處理量大，可再生重複使用節約成本等特點。

一、材料與儀器

1、材料、試劑

丹參根，山東省泰安市化馬灣20171121，經山東中醫藥大學李佳教授鑒定為丹參根；丹參酮標準品HPLC＞=98%，100mg/瓶；無水乙醇，試劑均為分析純；水為蒸餾水或同等純度的水；大孔樹脂D-290、D-301、D-101、D-201、AB-8。美國洋參衝劑(規格：4g/袋，金日製藥有限公司，批號：20170823)。肝糖原測定試劑盒，血乳酸測定試劑盒，血清尿素氮測定試劑盒，上海加科生物科技有限公司。

2、儀器

紫外-可見分光光度計，UV2550，日本島津公司；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋，常州國宇儀器製造有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風幹燥箱，鄭州南北儀器設備有限公司；TDL-80-2B離心機價上海安亭科學儀器有限公司；YP-B電子天平，上海光正醫療儀器有限公司；YRE-501旋蒸儀，鞏義市予華儀器有限公司；Agilent1260型高效液相色譜儀(Agilent1260四元泵，DAD檢測器，LC1260色譜工作站)；TC-C18色譜柱(5μm，4.6mmx200mm)；遊泳玻璃缸，自製；精密移液器、一次性吸頭。

3、實驗動物

清潔級昆明小鼠，雄性，體重20g～24g；由北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司提供，生產許可證號SCXK(滬)20012-0005。

二、單因素提取優化工藝

1、丹參提取液的製備(以最佳條件為例)

稱取一定量丹參根，用植物粉碎機粉碎，過40目篩。稱量200.0g置於2000mL圓底燒瓶中。加入8倍量(1600mL)85%乙醇，水浴鍋在70℃下回流提取3h，抽濾，濾液保存，濾渣重新倒入圓底燒瓶，重複以上實驗2次後，濾液保存，濾渣廢棄。將部分濾液置於圓底燒瓶中，溫度設置為50℃，轉速為30r/min，進行旋蒸，濃縮濾液至1.3～1.35g/mL。測量濃縮後的濾液體積，向其中加入3倍量熱水，將該溶液置於50mL離心：管中進行離心，時間10min，轉速4000r/min。離心停止後觀察上清液顏色，重複上麵步驟至上清液為無色，離心留下沉澱，用藥匙將沉澱轉移到蒸發皿中。沉澱在60℃水浴鍋內蒸幹，得到丹參提取物，稱量沉澱質量，備用。

2、影響丹參提取液中丹參酮純度的因素

回流時乙醇濃度、回流時間、回流溫度均可影響丹參酮純度。

回流乙醇濃度確定：75%、85%、95%。

回流溫度確定：60℃、70℃、80℃。

回流時間確定：2h、3h、4h。

按照表1條件進行實驗。

3、大孔樹脂的篩選

（1）樹脂的預處理

新樹脂首先用3mol/LNaOH浸泡8h，接著用水清洗至中性，再用3mol/L的HCl浸泡8h，用水洗至中性，再用95%乙醇浸泡24h，最後用水洗到樹脂無醇味。

（2）大孔吸附樹脂型號的選擇

準確稱取預處理過的大孔樹脂各1.0g，分別加入100mL丹參提取液置於250mL錐形瓶中，在水浴搖床(25℃、100～120r/min)上振蕩24h，測定吸附平衡後溶液中丹參酮的含量。接著用蒸餾水洗樹脂三次來除去表麵殘留的樣液，再加入50mL70%乙醇解吸24h後計算解吸率。以大孔樹脂的解析率、吸附率為指標，選擇最優的大孔樹脂。

吸附能力=(Co-Cv)xV/W

吸附率(%)=(Co-C₁)/Cox100

解析率(%)=(C₂xV₂)/[(Co-C₁)xVo]x100

式中：Co為初始樣液濃度，

C₁為平衡濃度，

C₂為洗脫液濃度，

Vo為初始樣液體積，

V₂為洗脫液體積，

M為樹脂幹重。

4、大孔樹脂優化丹參酮的條件優化

（1）吸附劑和上樣濃度的選擇

將8份預處理好的D101大孔吸附樹脂濕法裝柱，將丹參提取液溶於25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇後上樣。考察不同吸附劑對大孔樹脂吸附效果的影響。

將5份預處理好的樹脂用濕法裝柱，蒸餾水充分平衡，然後將濃度分別為2、4、6、8、10mg/mL的丹參提取液以2BV/h的流速上樣吸附，每0.5BV的流出液收集1份，測定流出液的丹參酮濃度，繪製泄漏曲線，根據曲線確定上樣濃度。

（2）解析液的選擇

將粗提物溶於55%乙醇後上樣。分別用60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的乙醇進行洗脫，通過薄層色譜檢測洗脫液中含有的成分[展開劑為石油醚(60～90℃):丙酮=4:1]，HPLC檢測各濃度洗脫液中丹參酮的純度，確定合適的洗脫劑。

（3）上樣流速對解吸效果的影響

將5份預處理好的樹脂濕法裝柱(30mL)，將50mL提取液經大孔樹脂完全吸附後，用150mL，50%的乙醇分別以1、2.3、4、5BV/h的流速上樣吸附，計算解析率。考察上樣流速對解吸效果的影響。

5、丹參酮純度的檢測

丹參提取液溶於70%乙醇經過D101大孔樹脂優化後，得到含有丹參酮的洗脫液。洗脫液通過旋轉蒸發儀濃縮脫醇，得到丹參酮粗提液。

高效液相色譜條件：AgilentTC-C18色譜柱(4.6mmx250mm，5μm)，流動相乙腈-水，等梯度洗脫；流速：1.0mL/min；測定波長：250nm；柱溫：35℃，進樣量10u。

6、抗疲勞試驗

（1）動物給藥及分組

將100隻雄性昆明小鼠(體重20～24g)隨機分成五組，每組20隻。按照中國藥典和《保健食品檢驗與評價技術規範》(2003版)，小鼠按照空白組、陽性對照組、丹參酮低劑量組、中劑量組、高劑量組隨機分為5組，空白對照組小鼠給予蒸餾水灌胃，陽性對照組給予洋參衝劑250mg/kg。給予丹參酮低劑量(200mg/kg)中劑量(400mg/kg).高劑量(1g/kg)。

（2）負重遊泳實驗

小鼠按照各劑量組分組，每組20隻，按照連續灌胃給藥20d，於末次灌胃1h後，在其尾巴根部纏繞自身質量5%的鉛塊，負重後置於水溫為25(±1)℃，水深30cm的塑料箱中，觀察其負重遊泳情況，紀錄小鼠從開始遊泳到死亡的時間，即小鼠的負重遊泳時間。

7、抗疲勞指標測定

根據《保健食品檢驗與評價技術規範》(2003版)的要求和相關文獻進行實驗。將小鼠按照各劑量組分組，每組20隻，連續灌胃給藥20d，末次灌胃30min後，置於水溫25(+1)℃、水深30cm的塑料箱中不負重遊泳90min後取出擦幹。摘取眼球采血，采用試劑盒法測定血清中尿素氮和乳酸的含量，接著處死小鼠，取出肝髒，用試劑盒測定肝糖原含量。

8、數據處理方法

用Excel建立實驗數據庫，組間比較單因素方差分析。

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