2.2.2堿溶液濃度和水解時間的液相幼儿選擇
以NIST 1849a配方乳粉質控樣作為研究對象，使用2、色谱食品3和4 mol/L 3種濃度的内标LiOH溶液分別水解18、20和22 h，法测測定的定婴色氨酸含量如圖4所示。由圖中數據可知，配方2和3 mol/L堿溶液經22 h仍沒有水解完全，中色而4 mol/L的氨酸LiOH在18 h已經水解完全，繼續水解20和22 h沒有明顯變化，含量為了保證充分的液相幼儿水解，以準確測定總色氨酸的色谱食品含量，選擇4 mol/L LiOH水解溶液、内标水解時間20 h作為最佳的法测水解條件
2.2.3水解溫度的確定
為考察水解溫度的影響，設計了100、定婴110、配方120 ℃ 3個水解溫度進行考察，結果見圖5。由圖中數據可見，110和120 ℃水解結果在18和20 h的時候無顯著差異，但120 ℃在22 h以後出現了明顯的下降；而在100 ℃條件下，樣品水解至22 h依然未能水解完全，且增加反應時間後，色氨酸濃度反而出現了下降，通過色氨酸標準品的堿水解實驗驗證，發現水解時間過長，遊離色氨酸會部分被破壞，故本方法選擇110 ℃作為水解溫度。
2.2.4堿水解法內標確定
由於堿水解過程溫度高，時間長，對不同的樣品進行加標回收試驗發現色氨酸長時間在高溫高濃度的堿中會有一定程度的損失，而且不同基質中色氨酸的損失不同。試驗增加了在堿水解過程中充氮保護的措施，結果表明色氨酸的損失在充入氮氣保護後略有改善，但使用充氮保護下堿水解的方法測試質控樣NIST1849a，結果僅為168 mg/100 g，不能達到滿意的結果；參考標準GB/T 15400—2018 《飼料中色氨酸的測定》在水解前對樣品進行除脂，試驗結果表明除脂僅對水解液的外觀有所改變，對測定結果沒有改善。因此在優化前處理方法無法有效降低色氨酸損失的前提下，采用色氨酸的結構類似物作為內標進行同步校正，提高定量準確性的同時簡化樣品處理步驟。本方法將5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸作為研究對象來考察其作為內標物定量堿水解方法測定色氨酸含量的可行性。
先後選擇了NIST質控樣1849a和1869作為研究對象，分別加入5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸內標後，進行堿水解。表2不同定量方式和不同內標的定量結果顯示，相同條件下以α-甲基-色氨酸作為內標得到的2個質控樣的含量均能滿足明示的範圍，而5-甲基-色氨酸作為內標得到的結果偏高，外標法定量的結果則達不到質控樣的明示下限。以α-甲基-色氨酸作為內標來定量能得到更為準確的結果。
2.3方法學驗證
2.3.1線性範圍和定量限
準確吸取色氨酸標準溶液（100 μg/mL）20、100和500 µL、1.0、2.0和5.0 mL於10 mL容量瓶中，加入100 µL內標（1 mg/mL）工作液，用水定容至刻度，混勻後得到濃度分別為0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的標準工作溶液，分別將標準係列工作液按照濃度由低到高的順序注入液相色譜儀中，測得相應色譜峰的峰麵積，以係列混合標準工作液的濃度為橫坐標，以目標化合物的峰麵積與內標的峰麵積的比值為縱坐標，繪製標準曲線。相關係數r＞0.999，覆蓋方法定量限和常見樣品的含量水平，線性良好。將S/N＞10且能準確定量的最低濃度點計算出的含量確定為方法的定量限。結果見表3。
2.3.2方法準確度和精密度
試驗選取代表性樣品進行加標回收試驗，樣品分別為嬰幼兒配方乳粉、乳蛋白部分水解樣品和氨基酸配方樣品，對樣品進行平行試驗得出本底值後再對每個樣品做0.5倍、1倍和2倍本底值水平的加標試驗，以回收率和相對標準偏差（RSD）評價方法的準確度和精密度。試驗樣品回收率和RSD見表4。樣品的平均回收率在92.5%~97.4%之間，RSD差均小於3.11%。將試驗樣品選取4家機構進行驗證，實驗室間RSD小於6.7%，顯示了良好的準確度和精密度。
2.3.3實際樣品應用
采用開發的方法對21個不同種類樣品進行測定。樣品包括不同品牌嬰幼兒配方乳粉8個、乳蛋白部分水解配方食品4個、乳蛋白深度水解配方食品4和氨基酸配方食品5個。樣品中色氨酸含量範圍為170~315 mg/100 g，回收率92%~98%，均符合GB 10765—2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》中對色氨酸含量的要求。
3.結論
本研究以α-甲基-色氨酸為內標物，采用堿水解-高效液相色譜法測定了乳粉及特殊醫學用途嬰兒配方食品中的色氨酸。內標法較好的校正了水解過程中高溫、高濃度堿溶液和不同基質在處理過程中對色氨酸的影響，同時省略了前處理過程中充氮氣保護等步驟，對該方法進行方法學驗證，也能得滿意的準確度和精密度。應用於不同種類的樣品和質控樣中目標物的測定均符合明示值，表明該方法操作簡單、準確度高，重複性好，適用於乳粉及特殊醫學用途嬰兒配方食品中色氨酸的準確定性定量，可為企業生產和有關部門監管提供理論支撐。
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