川芎為傘形科植物川芎的面法幹燥根莖，性味辛溫，优化氧化研究歸肝、川芎膽、蛋白心包經，工艺具活血行氣、及抗祛風止痛的活性功效。首載於《神農本草經》，面法為著名的优化氧化研究川產道地藥材。目前對川芎所含成分的川芎研究，主要集中於小分子成分，蛋白對川芎大分子成分的工艺研究甚少。前期研究初步表明，及抗川芎中含有豐富的活性蛋白質，且具有較好的面法抗氧化能力。天然蛋白質因其來源豐富、可生物降解、環境友好性和高生物活性等特點，近年來成為天然抗氧化劑的研究熱點。

氧自由基對生物大分子、氨基酸、DNA、脂類和蛋白質等造成氧化損傷且與癌症、動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病、神經功能障礙和免疫係統減弱等慢性疾病的發生有關。經研究發現，植物源蛋白質具有抗凝血、抗腫瘤、抗氧化和抗真菌等生物活性，如石斛蛋白提取液、葛根蛋白、豌豆蛋白、黑豆蛋白等均具有較好的抗氧化活性，對羥基自由基和DPPH自由基有良好的清除效果，大豆蛋白具有較強的DPPH自由基清除能力。目前，川芎蛋白（LCP）抗氧化能力的相關研究未見報道，本研究旨在通過Box-Behnken響應麵法確定其最佳提取條件；以DPPH自由基清除、羥自由基清除和超氧陰離子自由基清除率為指標，以抗壞血酸為陽性對照進行分析，考察LCP的抗氧化活性，同時為LCP的開發提供可靠的數據資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川芎，貴陽濟仁堂藥業有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、考馬斯亮藍R250、十二烷基硫酸鈉、Maker、抗壞血酸標準品（VC）北京索萊寶科技有限公司；DPPH自由基清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒、超氧陰離子清除能力試劑盒　蘇州格銳思生物科技有限公司。

PHS-3CpH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；AL204電子天平，美國梅特勒托利多公司；FD冷凍幹燥機，上海拓紛機械設備有限公司；MultiskanFC酶標儀，賽默飛（上海）世爾儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白濃度測定

分別吸取5mg/mL的標準溶液4、6、8、10、12、14、16、18、20μL於96孔板中，並用蒸餾水補足至20μL。分別加入200μLBCA工作液（BCA試劑與銅試液50:1）混勻，室溫靜置l0min，於650nm下檢測不同濃度牛血清蛋白溶液的吸光值A，以蛋白質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪製標準曲線，回歸方程為：y=2.2706x+0.0402（R2=0.9993）。川芎提取物中LCP濃度根據上述回歸方程求得。

1.2.2 單因素實驗

基於前期研究，以LCP得率為檢測指標，分別以pH、提取時間、料液比為影響因素以設計單因素實驗。

1.2.2.1 川芎藥材前處理

取幹燥潔淨的川芎藥材，粉碎，過3號篩（50目）。稱取適量過篩後的川芎藥材粉末置於圓底燒瓶中，加4倍量沸程為30～60℃石油醚水浴回流脫脂1h，靜置後過濾，將川芎藥材粉末於通風櫥自然晾幹，備用。

1.2.2.2 LCP的提取

精密稱取川芎藥材粉末3g，平行三份，加入Tris-HCl（68mmol/L，0.5%SDS，5%甘油，10%β-巰基乙醇）溶液，置於4℃冰箱浸提1.5h。5000r/min離心10min，收集上清，加入3倍量10%TCA-丙酮，置−20℃冰箱沉澱1.5h，5000r/min離心10min，收集沉澱，分別用丙酮及80%丙酮洗滌3次，5000r/min離心10min，收集沉澱，冷凍幹燥即得LCP，按公式（1）計算得率。

式中：M₁表示川芎蛋白凍幹粉的質量，g；M₂表示川芎藥材的質量，g。

1.2.2.3 不同pH對LCP得率的影響

按“1.2.2.2”項下操作，固定提取時間為1.5h，料液比為1:15g/mL，研究提取液pH（3、4、5、6、7、8、9）對LCP得率的影響。

1.2.2.3 不同pH對LCP得率的影響

按“1.2.2.2”項下操作，固定提取時間為1.5h，料液比為1:15g/mL，研究提取液pH（3、4、5、6、7、8、9）對LCP得率的影響。

1.2.2.4 料液比對LCP得率的影響

按“1.2.2.2”項下操作，固定提取時間為1.5h，提取液pH為6，研究料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30g/mL）對LCP得率的影響。

1.2.2.5 提取時間對LCP得率的影響

按“1.2.2.2”項下操作，固定料液比為1:20g/mL，提取液pH為6，研究提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5h）對LCP得率的影響。

1.2.3 LCP提取條件的響應麵試驗設計

為選擇最佳實驗條件，以A（提取時間h）、B（料液比g/mL）、C（提取溶劑pH）為獨立變量，蛋白得率為響應變量，采用DesignExport8.0.6的Box-Behnken響應麵方法（RSM）優化過程。各組平行3次，因素和水平見表1。

1.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳

采用賀小燕等試驗方法，以4.5%的濃縮膠和12.5%的分離凝膠進行SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80V電泳20min，分離膠電泳120V電泳80min，指示劑到達分離膠底部約1cm處停止電泳，考馬斯亮藍R250染色，脫色液脫色至條帶清晰。

1.2.5 LCP等電點測定

取10支潔淨離心管，稱重。根據表2，分別加入不同體積LCP溶液（50mg/mL），再分別加入不同濃度、不同體積的乙酸溶液或去離子水，混合，測定pH。於4℃靜置1h後，5000r/min離心15min。完全除去上清液後，將帶有沉澱物的離心管稱重，通過減重法計算沉澱質量。由於蛋白質在pI處沉澱最多，即可測定川芎的pI。

1.2.6 LCP溶解度的測定

將50mg樣品懸浮在10mL蒸餾水中，並使用1mol/mL的HCl或NaOH溶液將懸浮液的pH調節至2～12。將懸浮液在22℃下連續攪拌1h，並在5000r/min離心15min，BCA試劑盒測定上清液中蛋白質的量。溶解度按公式（2）計算。

式中：M₁：懸浮液中加入的蛋白總量，mg，M₂：離心後上清液蛋白的量，mg。

1.2.7 LCP抗氧化能力的測定

1.2.7.1 羥自由基清除能力的測定

取不同濃度的LCP溶液各0.125mL，按試劑盒加入反應試劑一、試劑二、試劑三各0.125mL和0.5mL的蒸餾水，混勻，即為測定組。取等體積蒸餾水，依法製備空白組。取不同濃度的LCP溶液液各0.125mL，加入反應試劑一、試劑二各0.125mL和0.625mL的蒸餾水，混勻，即為對照組。於37℃反應20min，轉移至玻璃比色皿中，蒸餾水調零，510nm讀取各組吸光度值A，平行測定3次，以VC為陽性對照組，公式（3）計算清除率。

式中：A₁：空白組吸光度值，A₂：測定組吸光度值，A₃：對照組吸光度值。

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