根據頂空固相微萃取法(HS-SPME)改進的方法[31]提取揮發性風味化合物，並用GC/MS進行分析。甲酸降解究將10mL“美樂”葡萄酒樣品和3.6gNaCl放入15mL萃取瓶中，乙酯再加入20uL20mg/L的固定3-辛醇標準溶液。萃取瓶用內襯密封，化研樣品在45℃下平衡20min，氨基微萃取在45℃、甲酸降解究500r/min的乙酯攪拌下持續60min。萃取結束將萃取頭插入進樣口解吸5min。固定
用Agilent7890B氣相色譜儀與5977A質譜儀進行GC-MS分析。化研色譜柱型號HP-Innowaxcolumn柱(60m×2.5mm×0.25μm)，氨基載氣是甲酸降解究流量為1mL/min的氦氣，進樣口溫度230℃。乙酯柱溫采用程序升溫：初始溫度50℃保留5min，固定以3％/min升至125℃保留3min，化研然後以2℃/min升至180℃保留3min，最後以15℃/min升至230℃保留15min。
質譜儀在電子轟擊源(EI)的電離模式下運行，使用問隔為0.2S的全掃捕模式(掃捕範圍m/z40～450)，離子源溫度200℃。
定性和定量分析：通過將各組分峰中的化合物與NISTl4.L譜庫的標準化合物進行匹配，並將得到的質譜和保留指數(RI)與NISTl4.L譜庫巾的標準化合物進行比較。用內標法計算各組分的相對含量，結果表示為3個重複的“美樂”葡萄酒樣品的平均值±標準差。
殼聚糖微球載體懸掛醛基的數量與其固定化酶能力的強弱有關。不同體積分數的戊二醛對殼聚糖微球載體上懸掛醛基質量分數的影響見圖2。
由圖可知，在一定範圍內，隨著戊二醛溶液體積分數的增加，載體上的懸掛醛基質量分數呈上升趨勢，但是當戊二醛溶液體積分數達到5％時，載體上懸掛醛基質量分數達2.4％，之後隨戊二醛體積分數增加，載體上懸掛醛基反而趨於平穩。使用不同加酶量，測得數據與此一致。結果說明，體積分數5％的戊二醛溶液已經可以提供足夠多數量的醛基與殼聚糖載體上的氨基發生交聯反應，此時載體對酶的固定量達到最大。因此載體製備時選用體積分數為5％的戊二醛溶液作交聯劑即可。
如圖3所示，在2～8h範圍內，載體上的懸掛醛基隨交聯時間的增加而增加；當交聯時問達到8h後，懸掛醛基的質量分數基本保持不變。說明8h的交聯時間足以使戊二醛溶液中的醛基與載體上的氨基充分反應，使載體對酶的固定量最大。因此，選擇8h作為殼聚糖微球載體和戊二醛溶液的交聯時間。
如圖4所示，通過遊離酶和同定化酶在30、36、42、48、54、60、66℃和72℃條件下的酶活結果可知，它們的最適溫度分別為30℃和42℃。同定化酶在30～42℃酶活性逐漸增高，最適溫度比遊離酶略高；在42℃以後降解EC能力逐漸降低，與酶活呈下降趨勢的遊離酶變化基本一致；但固定化酶的酶活在42～72℃均高於遊離酶。
出現最適溫度轉移可能是南於EC降解酶的空問結構受到同定化載體的影響而略有改變，尤其是在42℃以後，固定化EC降解酶的空間結構較為穩定，催化底物能力比遊離酶略高。也有其他研究結果表明固定化脲酶與遊離酶的最適催化溫度有所差異，但二者的催化效果並不存在顯著差異。
穩定性結果顯示，同定化EC降解酶在42℃條件下存放24h後相對酶活仍能達到60％以上，說明固定化EC降解酶能夠耐受一定範圍的溫度，對環境的適應性較好，在室溫環境下無需低溫保護，是一種環境友好型固定化酶。
從圖5可以看出，在pH為3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5和4.8的條件下，遊離酶和固定化酶催化底物EC的最適pH有所偏離，遊離EC降解酶對pH4.5的EC溶液具有最大的催化活性，且在pH3.0～4.5酶活性逐漸增加，相對酶活在30％～100％之問；同定化EC降解酶的最適pH為3.6～3.9，且在此範圍內酶活性均高於遊離酶，尤其在pH3.6左右表現出最大催化活性。
穩定性結果顯示，固定化酶在最適pH條件下反應時間越長，相對酶活性的下降速度越快，尤其是12～24h期問的相對酶活變化率遠遠高於0～12h的變化率。同定化酶在pH3.6條件下放置24h之後的酶活損失率不超過40％，說明固定化EC降解酶的耐酸性較遊離酶好，更適於複雜環境的操作。之前就有研究將以京尼平為交聯劑與來源於普羅維登斯菌(ProvidenciarettgeriJN-B815)的酸性脲酶進行交聯，發現此交聯酶能夠適應黃酒的複雜微環境並去除尿素和EC。
聲明：本文所用圖片、文字來源《食品與生物技術》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
相關鏈接：戊二醛，殼聚糖，3-辛醇
