隨著人們對自由基生命研究的面法不斷關注，氧化應激損傷和抗氧化保護作用的优化艺研究成為熱點。因人體中抗氧化的绿豆物質有限當氧化劑與人體內抗氧化劑失去平衡時，人體會處於氧化應激狀態。抗氧當體內的化肽氧化劑濃度超過細胞防禦能力時，氧化損傷可引起如癌症，备工多發性硬化症和心血管疾病等疾病。面法目前最常見的优化艺是化學抗氧化劑，但因其有一定的绿豆毒副作用所以使用受到限製。近年來研究發現，抗氧由蛋白酶水解製得的化肽生物活性肽具有一定的抗氧化能力，水解出的备工抗氧化肽與大分子蛋白質相比，顯具有更高的面法生物活性，抗氧化肽在體內積累具有清除自由基和抑製脂質過氧化的优化艺功能，能夠維持機體內自由基的绿豆平衡，從而提高機體抗衰老和抗疾病的能力。抗氧化肽因其具有安全、高效、易吸收等特點，在保健、醫療等領域受到了管飯的重視。
綠豆又名青小豆，屬於醫食兩用作物，是我國主要的糧食作物之一，在全國多地區種植，年均產量在6l萬噸且富含高質量的植物蛋白，是優質的食品加工原料。食用綠豆益處繁多，如可以降低血脂、提高機體免疫力、預防衰老以及具有抗氧化等作用。綠豆多肽中的抗氧化活性肽相對分子質量小，具有良好的水溶性、低黏度、穩定性強，是天然的抗氧化劑，能夠起到清除體內自由基、抑製生物大分子物質過氧化的作用，具有延緩衰老、預防疾病等優點，有很高的利用價值。但就目前而言，綠豆抗氧化多肽的製備工藝研究較少，不能滿足現階段的需求，生產成本較高，製備工藝不太成熟，對於綠豆多肽提取的研究有著重要意義。
一、材料與方法
1、材料及試劑
綠豆蛋白：實驗室自製；鹽酸：中國醫藥上海化學試劑公司；堿性蛋白酶(6000U/g)：Sigma試劑公司；氫氧化鈉、DPPH、無水乙醇：以上均為分析純，均購自天津市科密歐試劑有限公司。
2、主要儀器設備
紫外可見分光光度儀：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；精密pH計：梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；恒溫幹燥箱：湘儀離心機儀器有限公司；電子天平(RSJ200—4)：湘儀離心機儀器有限公司；離心機(TDZ5一WS)：湘儀離心機儀器有限公司。
3、實驗方法
（1）綠豆抗氧化肽的製備
將綠豆蛋白配置成一定濃度的溶液，水浴加熱至100℃進行15min均質處理。待溶液冷卻至酶解最適溫度，水浴保溫，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH調節其pH，酶解一段時間後100℃水浴滅活10min，室溫下離心(4000r／min，20min)，將上清液凍幹後保存。
（2）DPPH自由基清除能力的測定
參照於慧等人的方法進行DPPH自由基清除率的測定。將2mL一定濃度的綠豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L-1DPPH溶液進行混合，避光於25℃條件下反應30min，取出後於517nm波長下進行吸光值的測定，此時吸光度值記錄為Ai；將上述過程中的2mLDPPH溶液用無水乙醇取代，然後與2mL綠豆多肽溶液進行反應，此條件下測定吸光值記錄為Aj，將2mL無水乙醇與2mLDPPH溶液反應的條件作為空白組，此時記錄吸光值為Ao。
DPPH清除率計算公式如下：
Ai：樣品組吸光度值；
Aj：對照組吸光度值；
A0：空白組吸光度值。
（3）單因素實驗
本實驗在於研究酶法對綠豆蛋白水解的抗氧化肽的工藝優化，故以DPPH為指標，選擇酶解時間、酶解溫度、酶添加量以及pH為因素進行單因素實驗。
①酶解溫度對綠豆多肽抗氧化性的影響
將底物濃度為4％、pH為9、酶解時間3h作為固定條件，測定當酶解溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃五個條件下時的DPPH清除率。
②酶濃度對綠豆多肽抗氧化性的影響
將pH為9、酶解溫度50℃、酶解時間3h作為固定條件，測定當酶濃度分別為2％、4％、6％、8％、10％五個條件下時的DPPH清除率。
③pH對綠豆多肽抗氧化性的影響
將底物濃度為4％、酶解溫度50℃、酶解時間3h作為固定條件，測定當pH分別為7、8、9、10、11五個條件下時的DPPH清除率。
④酶解時間對綠豆多肽抗氧化性的影響
將底物濃度為4％、pH為9、酶解溫度50℃作為固定條件，測定當酶解時間分別為0.5h、lh、2h、3h、4h五個條件下時的DPPH清除率。
（4）響應麵優化設計
通過單因素實驗的結果，可以篩選出各因素的三個水平。所以在此基礎之上，應用統計分析軟件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，進行回應麵優化設計。因素和水平取值如表1所示。
二、結果與討論
1、單因素實驗結果
（1）綠豆多肽抗氧化性與酶解溫度的關係
將綠豆蛋白配置成一定濃度的溶液，水浴加熱至100℃進行15min均質處理。待溶液冷卻至酶解最適溫度，水浴保溫，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH調節其pH，酶解一段時間後100℃水浴滅活10min，室溫下離心(4000r／min，20min)，將上清液凍幹後保存。結果如圖1所示。
由圖1可知，當酶解溫度低於50℃，DPPH清除率與溫度成正比，當溫度超過50℃時，DPPH清除率開始下降。這是因為蛋白酶對穩定的要求較高，溫度過低會影響酶解的反應速度，使酶解反應不徹底，從而影響抗氧化肽的抗氧化效果。而溫度過高則會影響蛋白酶的活性，使蛋白酶的活性降低，無法使蛋白水解成具有抗氧化性的小分子肽段，從而使DPPH清除率降低。
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