糖蛋白是发芽分析廣泛存在於植物、動物和微生物機體內必不可少的糙米生物大分子，一般由多肽鏈和低聚糖鏈共價結合而成。糖蛋糖鏈影響多肽鏈或蛋白質的白抗折疊形態和整體構象。糖鏈與多肽鏈或蛋白質連接的炎降特殊結構使糖蛋白有多種存在形式，從而具有多種生物活性。血糖性糖蛋白具有預防腫瘤，发芽分析抗氧化，糙米降膽固醇，糖蛋提高機體免疫力等作用。白抗糙米發芽過程的炎降實質是糙米活化。發芽使糙米內部的血糖性多種酶被激發並且釋放，從結合狀態轉化為遊離狀態，发芽分析釋放出更多的糙米營養物質。發芽後的糖蛋糙米不僅含原有的肌醇六磷酸鹽、膳食纖維、多種抗氧化物質以及遊離態微量元素和多種維生素，還含有新生成的營養物質如γ-氨基丁酸等。其中蘊含的營養成分和活性物質顯著提高，食用和保健功能大幅度增加。有研究表明，糙米發芽後，其糖蛋白性能也有所改變，糖蛋白含量隨著萌發時間的延長而增加，且抗氧化性與萌發時間呈正相關。目前國內外對GBRG的相關研究鮮有報道。

本試驗采取超聲輔助提取GBRG，用DEAECellulose52陰離子交換層析法、SephadexG-200凝膠層析法分離純化，對純化的GBRG進行抗炎和降血糖性能分析。為進一步探尋消除炎症，改善胰島素抵抗的天然藥物功能性食品提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發芽糙米粗糖蛋白樣品製備

供試粳稻為“龍粳”，用龔穀機去除稻子外殼得到糙米，按照文獻將糙米發芽並製備發芽糙米粗糖蛋白樣品，凍幹保存備用。

1.1.2 試劑

DEAE-Cellulose52，日本Pharmacia集團；脂多糖，北京索萊寶有限公司；硫酸、磷酸、乙酸、氯化鐵、碘化鉀、苯酚、硫酸銅、鄰二氮菲、鐵氰化鉀、鹽酸羥胺、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、吡啶、乙酸酐、鹽酸（分析純）等，南京生物化學試劑研究中心；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖，上海和氏璧化工有限公司。

1.2 儀器與設備

680型酶標儀，日本Bio-Rad集團；CKX41型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Bj5060UV型CO2培養箱，美國Heraeus研究中心；DL-CJ-IN型超淨工作台，南京醫療儀器製造中心；T25細胞培養瓶、24孔細胞培養板、96孔細胞培養板，德國Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 發芽糙米粗糖蛋白的分離純化

分離純化流程GBRG粗品→上DEAE-Cellulose52陰離子柱→蒸餾水洗柱→氯化鈉洗柱→繪製梯度洗脫曲線→洗脫峰透析、除鹽、濃縮、凍幹→溶於蒸餾水→上SephadexG200瓊脂糖凝膠柱→氯化鈉洗柱→確定梯度洗脫曲線→洗脫峰透析、濃縮、凍幹備用。

每一步獲得的GBRG均使用考馬斯亮藍法、苯酚-硫酸法檢測其多糖及蛋白質含量。GBRG經DEAE-Cellulose52陰離子交換層析和SephadexG200瓊脂糖凝膠柱層析，得到3個糖蛋白組分峰，分別命名為WEG、SEG-1和SEG-2。采用高效液相色譜、紅外光譜、圓二色性、1H-NMR譜等方法進行結構分析，證明3個GBRG組分峰具有顯著的糖蛋白特征。

1.3.2 GBRG的抗炎作用研究

1.3.2.1 細胞模型的建立

參照Xie等、Kim等的試驗方法並加以調整，經100ng/mLLPS誘導RAW264.7細胞，建立細胞炎症模型。

1.3.2.2 MTT法測定細胞增殖活性

選用96孔培養板，分為3組：空白、對照、樣品，3孔/組。將處於對數生長期的RAW264.7細胞配成濃度1×10⁵個/mL的細胞懸液，各孔添加100μL，進行培育，過夜待用。各組分GBRG溶於細胞培養液，終濃度為濾膜微孔過濾，混入100μL濃度不一的含GBRG的培養液，再把培養板放於37℃、CO₂體積分數5%的培養箱中，連續孵育24h，混入200μL5mg/mLMTT溶液/孔，培育4h。使用1mL注射器收集各孔中的上清液，與100μLDM-SO混合，振動搖勻8min使結晶物全部溶解，570nm檢測細胞相對活力。

細胞相對活性=（樣品組-空白組）/（對照組空白組）×100%

1.3.2.3 RT-PCR測定細胞因子TNF-α、COX-2、IL-1β和iNOS的表達

（1）細胞分組

將RAW264.7細胞接於96孔板（5×10⁵個/mL），劃分成4組，培育過夜，各組包括3個重複孔。正常組：未加入LPS；LPS組：LPS質量濃度是1μg/mL；WEG糖蛋白組（50，100，200μg/mL）+1μg/mLLPS；SEG-1糖蛋白組（50，100，200μg/mL）+1μg/mLLPS；SEG-2糖蛋白組（50，100，200μg/mL）+1μg/mLLPS。先向細胞中添加各濃度糖蛋白，1h後加入LPS孵化24h。

（2）引物設計

按照IL-1β、β-actin、COX-2、iNOS與TNF-α的基因序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司設計並合成。具體內容如表1所示：

（3）RNA提取

選擇總RNA試劑盒用以提取RAW264.7細胞的總RNA，測定RNA濃度。

（4）逆轉錄反應

逆轉錄反應的試劑為50ng～5μg總RNA、1μL引物Oligo（dT）₁₈（0.5μg/μL）、10μL2×ES反應液、1μLRT/RI逆轉錄酶、1μLgDNA。將RNA模板、引物和DEPC水混合，65℃孵育5min後，冰浴2min，加入引物Oligo（dT）18，用於逆轉錄試驗。42℃孵育15min，最後85℃孵育，使RT/RI與gDNA酶進行逆轉錄反應。

（5）PCR擴增

對逆轉錄所得到的cDNA進行PCR。在PCR管中加入SYBRGreen染料5μL、上遊引物0.3μL、下遊引物0.3μL、待測cD-NA5μL、DEPC水2.4μL。低速離心30s，使管內溶液完全混合，然後用RealtimePCR儀進行PCR擴增。反應條件為：94℃，5min預變性；65℃、2min，94℃、2min，共30個循環。

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