槐米是高效豆科植物槐的幹燥花蕾，有涼血止血，液相清肝瀉火等功效。色谱蘆丁為槐米的法测主要活性成分，目前我國醫藥工業中常以槐米為主要原料提取蘆丁，定槐的不度评定含量最高可達30%左右。米中蘆丁屬於黃酮類化合物，芦丁研究表明，确定蘆丁具有抗心腦血管疾病、高效免疫調節作用、液相抗氧化、色谱延緩衰老等作用。法测蘆丁可以直接作為藥品，定槐的不度评定也用於複配和藥物的米中中間體，可用作抗氧劑及天然食用黃色素。芦丁國外主要用於食品、化妝品的添加劑和著色劑。

本實驗建立了槐米中蘆丁含量測定的高效液相色譜方法，參考JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》和CNAS-GL06《化學分析中不確定度的評估指南》建立數學模型，定量測定不確定度的各個分量，考察影響不確定度的主要因素，初步建立了適用於評估HPLC法測定槐米中蘆丁含量不確定度的方法，以期加強對含量測定結果準確性和可信度的認識，為樣品前處理步驟繁瑣的分析方法建立有效的不確定度評定程序提供參考。

一、材料與方法

1、材料與試劑

蘆丁標準品（含量HPLC：90.5%）；甲醇為色譜純；水為超純水；其餘試劑均為分析純；槐米藥材收集於山西、陝西和廣西等地，經山西省林業科學研究院張素華高級工程師鑒定為豆科植物槐SophorajaponicaL的花蕾。

2、儀器與設備

LC-2010AHT高效液相色譜儀；AB104.N分析天平；KQ3200DE數控超聲清洗器；UPHW-I-90T型優普係列超純水係統。

3、實驗方法

（1）對照品溶液的製備

精密稱取蘆丁對照品5.4mg，置於50mL容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，得0.0979g／L的儲備液，4℃冰箱中保存備用。

（2）供試品溶液的製備

稱取槐米粗粉約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率25kHz）30分鍾，放冷後再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液2mL，置10mL量瓶中加甲醇至刻度，搖勻，0.45μm濾膜濾過作為供試品溶液。同時以甲醇做空白對照溶液。

（3）色譜條件

色譜柱：Agela.InnovalC18（4.6mm×250mm，5μm）反相色譜柱；檢測器：紫外檢測器；柱溫：30℃；流速：1.0mL／min。流動相∶甲醇-1%冰醋酸溶液（32∶68），等度洗脫；檢測波長：257nm，進樣量：10μL。

4、數學模型

槐米中蘆丁的計算公式為：

式中：X為樣品中蘆丁含量，%；C為供試液中蘆丁濃度，g／L；V為供試液體積，mL；m為樣品質量，g；F為稀釋因子。

5、不確定度來源分析

本方法操作步驟相對複雜，影響因素較多，通過分析整個實驗過程的影響因素，並參照含量計算公式，分析不確定來源主要包括：樣品製備均勻度、樣品的定容、標準品、標準曲線的擬合和儀器重複性等方麵。

二、來源與分析

1、樣品製備均勻度引入的不確定度

被測樣品花蕾不同部位的蘆丁含量差異較大，按照標準取樣方法，將同一批次樣品全部粉碎混勻後，稱取10份按槐米粗粉約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50mL甲醇，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率25kHz）30分鍾，放冷後再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液2mL，置10mL量瓶中加甲醇至刻度，搖勻，0.45μm濾膜濾過作為供試品溶液。同時以甲醇做空白對照溶液分別測定，評定樣品製備的均勻度，測定結果見表1。另外重複性測量已包括在樣品均勻度的試驗中。

蘆丁含量的平均值：X-=18.54%

測定標準差Sx用貝塞爾公式計算：

樣品分布均勻度引入的相對標準不確定度u（x）為：

2、樣品定容引入的不確定度

（1）由校準引入的標準不確定度

根據JJG196—2006《常用玻璃量具檢定規程》，A級50mL單標線吸量管最大允差為±0.050mL，A級2mL分度吸量管最大允差為±0.012mL，A級10mL單標線容量瓶最大允差為±0.020mL，屬B類評定，按照矩形分布考慮，k=根號3，合成校準引入的相對不確定度：

（2）由溫度變化引入的標準不確定度

在樣品處理過程中需量取甲醇50mL、續濾液2mL並定容至10mL，實驗室的溫度在±4℃之間變動，20℃甲醇體積膨脹係數為1.19×10-³／℃。在實驗操作時，移液管和容量瓶中的溶液所處環境的溫度差異很小，因此可以忽略不計。假設溫度變化是矩形分布，由溫度變化產生的不確定度根據公式（2）計算，結果為：u（t₁)=0.137,u(t₂)=0.00550,u(t₃)=0.0275

合成溫度引入的相對標準不確定度：

由上述分量合成樣品定容引入的相對標準不確定度為：

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